Trasferimento di geni mediato da Agrobacterium nelle piante | Biotecnologia (con diagramma)

Trasferimento di geni mediati da Agrobacterium nelle piante!

L'Agrobacterium è un batterio patogeno gram-negativo coinvolto nel causare la malattia della formazione della galla coronarica nelle specie vegetali. La formazione di galle coronarie è dovuta al trasferimento di un segmento di DNA oncogenico (che causa il cancro) nella cellula della pianta nei siti feriti.

Questo segmento di DNA (trasferimento di DNA o T-DNA) è presente su plasmidi di grandi dimensioni chiamati plasmidi tumorali (Ti) nel batterio. Il T-DNA (circa 20 kb di lunghezza) è integrato nel cromosoma della pianta mediante ricombinazione. Una serie di geni di virulenza (vir) sono coinvolti nella direzione del processo di infezione. Quindi, quando una radice o uno stelo di una pianta viene ferita, emette una certa risposta.

In risposta a questi segnali, i geni vir di A. tumefaction si attivano e dirigono una serie di eventi richiesti per il trasferimento del T-DNA dal plasmide Ti al cromosoma della pianta. La funzione di diversi geni vir include una copia del T-DNA, seguita dall'attaccamento di un prodotto al filamento di T-DNA copiato per agire da leader, successivamente aggiungere proteine ​​insieme alla lunghezza del T-DNA, possibilmente come un protettivo meccanismo.

Questi alla fine aprono un canale nella membrana cellulare batterica, attraverso cui passa il T-DNA. Il T-DNA entra quindi nella pianta attraverso la ferita. Tuttavia, non è ancora chiaro come il DNA batterico si muova dal citoplasma al nucleo della cellula vegetale, o come il T-DNA si integri nei cromosomi vegetali.

Per utilizzare questi batteri come vettore, la sua regione T-DNA viene rimossa eccetto le regioni di confine e i geni vir. Il transgene viene quindi inserito tra le regioni del T-DNA, dove viene trasferito alla cellula vegetale e viene integrato nel cromosoma della pianta (Figura 1). Il T-DNA è clonato in plasmidi Ti, che vengono tagliati a misura e replicati in E.coli per facilitare ulteriori manipolazioni. Questi vettori vengono mobilizzati nei ceppi ospite di Agrobacterium e usati per infettare i tessuti vegetali.

Questi tessuti vegetali infetti vengono successivamente coltivati ​​su terreni contenenti sostanze chimiche specifiche, regolatori di crescita per facilitare la rigenerazione delle cellule trasformate. La selezione dei trans-formanti viene effettuata in presenza di un antibiotico presente nel terreno di coltura. Le piante trasformate vengono infine analizzate per l'integrazione stabile e l'analisi funzionale del gene inserito.

Protoplast Fusion:

Le cellule senza la parete cellulare sono indicate come protoplasti. Questi protoplasti possono assorbire il DNA direttamente in presenza di alcuni prodotti chimici (come il polietilenglicole, il PEG). Una maggiore concentrazione di PEG causa la permeabilizzazione della membrana plasmatica, che consente l'assorbimento del DNA nei protoplasti. Anche i segnali elettrici possono essere utilizzati per creare piccoli fori nella membrana del plasma passando una corrente elettrica.

Questo è noto come elettroporazione. Queste piccole aperture aiutano poi l'assorbimento del DNA estraneo da parte dei protoplasti. Questo è successivamente seguito dalla formazione della parete cellulare e dall'iniziazione della divisione cellulare. Tuttavia, la produzione di piante transgeniche mediante trasferimento genico diretto a protoplasti dipende da un efficiente sistema di protoplasto per la rigenerazione delle piante.

Gene-gun o trasferimento genico del gene:

Questa è la tecnica più recente in cui si può consegnare il DNA di interesse in una cella caricando le micro-particelle (come l'oro o il tungsteno) ad alta velocità. Questo processo di consegna del DNA è chiamato bombardamento. All'interno della cellula, le molecole di DNA vengono rilasciate dalle particelle e alla fine questo DNA viene integrato nel genoma nucleare o degli organelli della cellula ospite.

Le piante del tessuto vengono infine coltivate su terreni contenenti ormoni / antibiotici specifici per selezionare le piante trasformate. Una volta trasferito il gene di interesse nell'ospite desiderato, è necessario stabilire la sua integrazione stabile, che viene effettuata rigenerando le piante. Ciò è ottenuto con la tecnica della coltura del tessuto.

Il processo della cultura dei tessuti può essere suddiviso in quattro fasi:

Fase I:

Include la selezione degli espianti adatti e il suo trasferimento al terreno nutritivo.

Fase II:

Include la proliferazione dei tessuti in crescita sul mezzo di moltiplicazione.

Fase III:

Include il trasferimento del tessuto in crescita (callo) ai supporti dove può differenziarsi nelle sue varie parti.

Stadio IV:

Include il trasferimento di piantine nell'ambiente naturale. Tuttavia, i geni di interesse possono essere aggiunti in due modi come orientamento sensato e antisenso. Per esprimere o sovra esprimere il gene si può mettere il gene in orientamento sensoriale. Tuttavia, se si vuole bloccare il prodotto indesiderato o un passaggio in un percorso biochimico, si può mettere il gene in un orientamento antisenso.