Mirare a isolare diversi batteri presenti in un determinato campione e mantenere le loro culture pure

Cerca di isolare diversi batteri presenti in un dato campione e di mantenere le loro colture pure.

Scopo:

I batteri presenti in natura non si presentano come specie segregate, ma si presentano come popolazioni miste di specie diverse.

Pertanto, per studiare le singole specie di batteri, è prima necessario separarli dalla popolazione mista. Questo processo è chiamato "isolamento dei batteri".

Si ottiene facendo crescere la popolazione mista di batteri sulla superficie di un terreno solido in colonie discrete. Le "colonie" sono masse individuali e macroscopicamente visibili di batteri cresciute sulla superficie del mezzo solido, ciascuna delle quali rappresenta la moltiplicazione di un singolo batterio.

Poiché ogni colonia proviene dalla crescita e ripetuta moltiplicazione di un singolo batterio, tutti i batteri presenti nella colonia appartengono alla stessa specie. Quindi, ciascuna colonia rappresenta una popolazione molto grande di una singola specie di batteri.

Queste colonie vengono trasferite in modo asettico per separare le inclinazioni dell'agar nutritivo e lasciate crescere lì. Le specie isolate di batteri, coltivate separatamente sugli agar slant, sono chiamate "pure culture". In ogni 15-30 giorni, vengono trasferiti su slant freschi, in modo che non perdano le loro caratteristiche originali a causa di sovraffollamento, mancanza di sostanze nutritive e accumulo di metaboliti.

In questo modo, colture pure di batteri vengono mantenute in laboratorio mediante trasferimento ripetuto a slant freschi a intervalli regolari. Questo processo è noto come "mantenimento della cultura pura". Le colture pure vengono mantenute in laboratorio per la loro successiva identificazione mediante varie tecniche di colorazione, biochimica, sierologica e molecolare, nonché per il loro uso futuro.

Le "culture stock" sono colture pure standard, la cui identificazione è stata stabilita a livello internazionale a livello di genere, sottospecie, tipo o sottotipo. Sono mantenuti in laboratori di microbiologia riconosciuti a livello internazionale.

Altri laboratori possono ottenerli da questi laboratori e mantenerli nei propri laboratori come le loro colture, mediante trasferimento ripetuto a slant freschi a intervalli regolari. Sono utilizzati per l'identificazione confermata di colture pure ottenute in questi laboratori confrontando le loro caratteristiche con quelle delle colture standard.

Principio:

La popolazione mista di batteri presenti in un dato materiale (solido, liquido o superficiale) viene coltivata su piastre di agar nutrienti mediante piastra di diffusione o metodo con piastra di strisciatura come descritto precedentemente in "Coltivazione di batteri". Ogni colonia isolata che si trova su una piastra di agar è composta da una specie di batteri, poiché ogni colonia cresce da un singolo batterio.

Pertanto, i batteri vengono isolati su piastre di agar mediante due tecniche come segue:

(a) Tecnica di piastre di diffusione

(b) tecnica della piastra di striscia

Le colonie rappresentative (colonie con caratteristiche dissimili) sono selezionate e inoculate asetticamente per separare le inclinazioni dell'agar per ottenere le colture pure. Dopo ogni 15-30 giorni, vengono trasferiti su slant freschi per il mantenimento di queste colture pure.

Materiali richiesti:

Provette (5 n.), Matraccio conico da 250 ml (1 no), NaOH 0, 1 N, HCI 0, 1 N, acqua distillata, agar nutriente, cotone non assorbente, cappio, carta artigianale, filo (o nastro di gomma), carta pH (o pHmetro), bruciatore bunsen, autoclave, camera a flusso laminare, incubatore, piastre contenenti colonie isolate di batteri (piastra di diffusione o piastra a strisce).

Procedura:

1. Gli ingredienti del terreno di agar nutritivo o della sua polvere pronta per il fabbisogno di 100 ml del terreno vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in un matraccio conico da 250 ml agitandoli e agitandoli (Figura 6.4).

2. Il suo pH è determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 0 usando 0, 1 N HC1 se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore.

3. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno.

4. Prima che si solidifichi, il terreno in condizioni di fusione fusa viene distribuito in 5 provette (circa 20 ml ciascuna).

5. Le provette sono tappate in cotone, coperte con carta artigianale e legate con filo o elastico.

6. Sono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

7. Dopo la sterilizzazione, vengono rimossi dall'autoclave e mantenuti in una posizione inclinata per raffreddare e solidificare il terreno. Queste provette contenenti terreno di agar nutriente solidificato in condizioni oblique sono chiamate "slant agar nutrienti".

8. I passaggi 10 e 11 devono essere eseguiti seguendo la tecnica asettica preferibilmente in una camera a flusso laminare. La bocca dei contenitori contenenti i terreni o le colture sterilizzati deve essere esposta sulla fiamma del bruciatore Bunsen dopo aver rimosso il tappo di cotone e prima di rimetterlo.

Cicli, prima dell'uso devono essere sterilizzati su fiamma da riscaldamento a rosso caldo e poi di raffreddamento per 30 secondi per raffreddare a temperatura ambiente. Non dovrebbero mai essere usati quando sono molto caldi, poiché uccidono i microbi quando li toccano.

9. Nell'esperimento precedente, se si potevano osservare colonie isolate sulla piastra di diffusione o sulla piastra di strisciamento, cinque colonie con caratteristiche dissimili sono selezionate come colonie rappresentative.

10. Un ciclo viene sterilizzato sulla fiamma e un ciclo di batteri da ciascuna delle colonie rappresentative viene prelevato in modo asettico. Il ciclo viene introdotto nell'agar inclinato, in modo che il ciclo dei batteri vada alla fine del taglio. L'anello viene spostato verso l'esterno in maniera ondulata toccando la superficie del taglio, in modo che si formi una linea ondulata.

11. Il cappio è sterilizzato a fiamma e in modo simile il resto delle quattro colonie rappresentative vengono inoculate separatamente nella sinistra su quattro slant. Il ciclo è sterilizzato dopo ogni inoculazione.

12. I cinque slant inoculati vengono incubati a 37 ° C per 24 ore in un incubatore.

Osservazioni (caratteristiche culturali):

(i) Una linea ondulata con crescita lungo la sua lunghezza osservata:

La crescita ha avuto luogo.

L'inclinazione è osservata per le caratteristiche di inclinazione come segue (Figura 6.5).

1. Abbondanza di crescita:

La quantità di crescita è indicata come nessuna, leggera, moderata o grande.

2. Pigmentazione:

I microrganismi cromogeni possono produrre pigmenti intracellulari responsabili della colorazione dell'organismo come osservata nelle colonie di superficie. Altri organismi producono pigmenti solubili extracellulari che vengono escreti nel mezzo e producono anche un colore. La maggior parte degli organismi, tuttavia, non è cromocromica e apparirà da bianca a grigia.

3. Caratteristiche ottiche:

Le caratteristiche ottiche possono essere valutate sulla base della quantità di luce trasmessa attraverso la crescita.

Queste caratteristiche sono descritte come:

(un) Opaco: nessuna trasmissione della luce.

(B) Traslucido: trasmissione parziale della luce.

(C) Trasparente: trasmissione a luce piena.

4. Forma:

L'aspetto della singola linea di crescita sulla superficie dell'agar è designato come segue:

(un) Filiform: crescita continua e filiforme con bordi lisci.

(B) Echinulate: crescita continua, filiforme con bordi irregolari.

(C) Perline: colonie non confluenti con semi-confluenti.

(D) Effetto: crescita sottile e diffusa.

(E) Arborescente: crescita ad albero.

(f) Rhizoid: crescita simile a una radice.

(ii) Nessuna crescita lungo la linea di inoculazione:

Tecnica difettosa di inoculazione, l'inoculazione viene ripetuta C Enumerazione di batteri.

C. Enumerazione di batteri:

L'estensione dell'attività batterica in un dato campione in un insieme definito di condizioni dipende principalmente dal numero totale di batteri presenti in esso indipendentemente dalla loro specie. Pertanto, è molto spesso richiesto di scoprire il numero totale di batteri presenti nei campioni di cibo, acqua, suolo, aria e tessuto durante la loro analisi microbiologica.

La stima del numero di batteri in un dato campione è chiamata "enumerazione di batteri". Esistono vari metodi di enumerazione dei batteri come indicato di seguito. Tutti questi metodi richiedono che i batteri siano presenti in una sospensione omogenea.

Ecco perché si presume che i campioni liquidi siano sospensioni omogenee di batteri e siano direttamente utilizzati, mentre i campioni solidi vengono omogeneizzati in soluzioni saline sterili, in modo da ottenere sospensioni omogenee di batteri.

Non usato comunemente:

(I) Metodi diretti:

(a) Conteggio microscopico diretto

(b) Contatore di celle elettronico

(II) Metodi indiretti:

(c) Metodi chimici

(D) Metodo turbidimetrico

(E) Conteggio filtri a membrana

Più ampiamente usato:

(f) Metodo di placcatura con agar diluizione seriale o conteggio totale delle placche (metodo TPC)

(a) Conteggio microscopico diretto:

In questo metodo, il numero di batteri presenti in un'aliquota della sospensione omogenea di batteri viene contato direttamente al microscopio e il numero totale di batteri nel campione viene determinato matematicamente.

Il vantaggio di questo metodo è che è molto rapido. Gli svantaggi sono che vengono contate sia le cellule vive (vitali) sia quelle morte e il metodo non è sensibile a popolazioni di meno di un milione di batteri per millilitro.

Il conteggio può essere fatto in due modi come segue:

(i) Camera di Petroff-Hauser:

È una camera di conteggio specializzata, in cui un'aliquota della sospensione omogenea di batteri viene messa per conteggio direttamente al microscopio.

(ii) Ratto di razza:

Le cellule di batteri vengono contate direttamente al microscopio usando strisci macchiati confinati in un'area di 1 mm 2 sul vetrino. Viene utilizzato principalmente per l'enumerazione dei batteri nel latte.

(b) Contatore di celle elettronico:

Un contatore di celle elettronico come "Coulter counter" è usato per contare direttamente il numero di cellule di batteri. Una sospensione omogenea di cellule di batteri preparate in un fluido conduttore viene lasciata passare attraverso un orifizio minuto, attraverso il quale scorre una corrente elettrica.

La resistenza all'orifizio è registrata elettronicamente. Quando una cellula passa attraverso l'orifizio, essendo non conduttrice, aumenta momentaneamente la resistenza. Il numero di volte in cui la resistenza aumenta momentaneamente viene registrato elettronicamente, il che indica il numero di batteri presenti nella sospensione.

Il vantaggio di questo metodo è che è estremamente rapido. Gli svantaggi sono che vengono contate sia le cellule vive (vitali) sia quelle morte e lo strumento non è in grado di distinguere tra cellule batteriche e particelle inerti.

(c) Metodi chimici:

Questi metodi stimano la quantità di tali sostanze, principalmente chimiche, che aumenta con l'aumento della popolazione batterica.

I parametri principali stimati sono i seguenti:

(i) concentrazione proteica

(ii) concentrazione del DNA

(iii) Peso a secco

(iv) produzione di anidride carbonica

(v) Assorbimento di ossigeno

(vi) produzione di acido lattico

(d) Metodo turbidimetrico:

Quando i batteri vengono coltivati ​​in terreni ricchi di nutrienti liquidi (ad es. Brodo nutriente), la loro crescita abbondante rende i media torbidi, poiché le cellule batteriche rimangono per lo più sospese in essi. La torbidità aumenta con l'aumento del numero di cellule nel supporto. Con l'aumentare della torbidità, aumenta la "assorbanza" o la "densità ottica (OD)" del materiale.

Il diametro esterno della sospensione delle cellule batteriche nel mezzo viene misurato usando uno spettrofotometro a 600 nm. Il numero di cellule batteriche nella sospensione viene rilevato confrontando la DO con una curva standard preparata tracciando i valori OD per diverse concentrazioni conosciute di batteri. Il metodo è rapido, ma limitato alle sospensioni batteriche di oltre 10 milioni di cellule.

(e) Conteggio filtri membrana:

Questo metodo viene utilizzato quando il numero di batteri in un campione liquido è molto inferiore. Per aumentare la concentrazione di batteri, prima il campione liquido viene filtrato in modo asettico attraverso un apparato filtrante a membrana sterilizzato utilizzando un filtro a membrana sterile.

Il filtro a membrana contenente i batteri intrappolati viene trasferito in modo asettico in una capsula di Petri sterile contenente un tampone assorbente saturo con un mezzo liquido differenziale selettivo. Il mezzo trasuda sulla superficie del filtro. Dopo l'incubazione, il numero di colonie formate sul filtro viene contato usando un semplice microscopio.

(f) Metodo di placcatura dell'agar per diluizione seriale o metodo TPC:

È il metodo più versatile e ampiamente utilizzato per il conteggio dei batteri.