I batteri sono presenti in un campione mediante metodo di placcatura dell'agar di diluizione seriale o metodo di placca totale (TPC)

Total Plate Count (TPC):

Per enumerare i batteri presenti in un campione mediante metodo di placcatura di agar diluizione seriale o conteggio totale delle placche (TPC).

Scopo:

L'estensione dell'attività batterica in un dato campione in un insieme definito di condizioni dipende principalmente dal numero totale di batteri presenti in esso indipendentemente dalla loro specie.

Pertanto, è molto spesso richiesto di scoprire il numero totale di batteri presenti nei campioni di cibo, acqua, suolo, aria e tessuto durante la loro analisi microbiologica. Questo numero totale di batteri include sia batteri vivi che morti ". I batteri morti non possono crescere e riprodursi.

Sono solo i batteri viventi (batteri vitali), che possono crescere e moltiplicarsi con conseguente attività batterica specifica. Pertanto, è molto spesso necessario enumerare le cellule batteriche vitali in diversi campioni. Tuttavia, la maggior parte dei metodi di enumerazione come il conteggio microscopico diretto, il conteggio delle cellule elettroniche, i metodi chimici e il metodo spettrofotometrico contano sia cellule vive che cellule morte.

Questi metodi non possono discriminare tra cellule viventi e morte. Pertanto, il metodo di placcatura dell'agar di diluizione seriale, che enumera solo le cellule batteriche vitali, è il metodo universalmente utilizzato per contare le cellule vitali viventi in diversi campioni.

Principio:

Un peso definito di campione solido viene omogeneizzato in modo asettico in nove volumi di soluzione salina sterile per ottenere una sospensione omogenea di batteri. Il campione liquido viene utilizzato direttamente come sospensione omogenea dei batteri. Le sospensioni di batteri così ottenuti sono diluite in serie (10 volte, 100 volte, 1000 volte ecc.). Qui 10 -1, 10 -2, 10 -3 ecc. Sono chiamati diluizioni.

I loro reciproci (10 1, 10 2, 10 3 ecc.) Sono chiamati fattori di diluizione. Un volume definito della sospensione di batteri da ciascuna diluizione viene inoculato su piastre di agar e diffuso correttamente, in modo da distanziare le singole cellule batteriche e isolarle l'una dall'altra.

L'inoculazione dei batteri per la sua elencazione avviene in due tecniche come segue:

1. Tecnica del piatto di versamento

2. Tecnica della piastra di diffusione

1. Tecnica del piatto di versamento:

In questa tecnica, 1 ml della sospensione di batteri viene fatto cadere su una piastra di Petri sterilizzata e quindi viene versato su di esso il terreno di agar nutritivo liquefatto. La capsula di Petri viene fatta ruotare delicatamente, in modo da consentire alla sospensione di miscelarsi uniformemente con il mezzo. Si lascia raffreddare e solidificare.

2. Tecnica della piastra di diffusione:

In questa tecnica, 0, 1 ml della sospensione di batteri viene fatta cadere su una piastra di agar preparata. Quindi, la goccia di sospensione viene distribuita uniformemente sulla piastra di agar da un diffusore di vetro sterilizzato.

Per ridurre al minimo l'errore, ciascuna sospensione diluita viene piastrata su 2-5 piastre replicate. Le piastre inoculate sono incubate a 37 ° C per 24 ore. Durante questo periodo, ogni singola cellula batterica isolata sulla piastra di agar cresce e si moltiplica rapidamente per produrre una massa macroscopica visibile di cellule di batteri chiamate "colonie". Pertanto, il numero di colonie sul piatto rappresenta il numero di batteri nel campione.

Tuttavia, molto spesso, durante la diffusione, alcune cellule potrebbero non essere separate correttamente e poche di queste cellule non separate possono dare origine a una singola colonia. Inoltre, poche cellule hanno la tendenza a rimanere in coppie, catene o cluster.

Qui, ogni coppia, catena o gruppo produce una colonia. Pertanto, ciascuna colonia, in senso stretto, non rappresenta un singolo batterio. Ecco perché, invece di esprimere i conteggi dei batteri come "No. di batteri / gm o ml di campione », è molto spesso espressa come numero di unità formanti colonie per gm o ml (CFU / gm o ml).

Il numero totale di piastre (TPC) nel campione originale viene calcolato moltiplicando il numero di CPU con i rispettivi fattori di diluizione. Le "regole di enumerazione" sono seguite, mentre si calcola il numero di batteri nel campione originale.

Materiali richiesti:

Piastre di Petri (15 n.), Pipette da 2 ml (10 n.), Pipetta da 10 ml (1 n.), Provette (10 n.), Matracci conici (500 ml e 1 litro-1 n. Ciascuno), Bicchiere da 500 ml (2 n.), Diffusore di vetro, astuccio per pipette in acciaio inossidabile, carta artigianale, filo (o elastico), cotone non assorbente, alcool etilico, cloruro di sodio (NaCl), acido cloridrico 0, 1 N (HCI), Idrossido di sodio 0, 1 N (NaOH), acqua distillata, agar nutriente, campione liquido (ad es. Acqua dello stagno / acque reflue), campione solido (ad es. Suolo / pesce carne / ostriche / alimenti lavorati), carta pH (o pHmetro), pestello e malta (o omogeneizzatore), bruciatore bunsen, forno ad aria calda, autoclave, incubatore, camera a flusso laminare, contatore di colonie Quebec.

Procedura:

1. Dieci pipette (in un contenitore per pipette in acciaio inossidabile), 15 piastre di Petri e un paio di pestello e mortaio (o una tazza omogenea) vengono sterilizzate in forno ad aria calda a 180 ° C per 3 ore. In alternativa, possono essere coperti con carta artigianale, legati con filo o elastico e sterilizzati in autoclave insieme al mezzo (Figura 6.6).

Il numero di piastre di Petri e di conseguenza la quantità di terreno da utilizzare viene calcolato in base al numero di repliche e diluizioni richieste. Qui, il vetro e il supporto sono stati presi per la replicazione singola e la diluizione fino a 10 -6 . Il numero di bicchieri e la quantità di terreno prelevato per la sterilizzazione è leggermente maggiore per evitare qualsiasi errore incidentale, poiché la sterilizzazione è un processo lungo.

2. 4, 25 g di NaCl vengono sciolti in 500 ml di acqua distillata per ottenere una soluzione salina fisiologica (0, 85%). 225 ml di questa soluzione salina vengono versati in un matraccio conico da 500 ml. La sua bocca è ricoperta di cotone, coperta con carta artigianale e legata con filo o elastico. Viene utilizzato come primo diluente per diluire il campione solido.

3. 9, 0 ml di soluzione fisiologica sinistra vengono anche pipettati in ciascuna delle 10 provette. Le loro bocche sono ricoperte di cotone, coperte con carta artigianale e legate con filo o elastico. Questi sono usati come diluenti per la diluizione seriale.

4. Gli ingredienti del terreno di agar nutritivo o della sua polvere pronta per il fabbisogno per 500 ml del mezzo vengono pesati e sciolti in 500 ml di acqua distillata in una beuta da 1 litro agitandoli e agitandoli.

Il suo pH viene determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 0 usando HC1 0, 1 N se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno. Quindi, è coperto di cotone, coperto con carta artigianale e legato con filo o elastico.

5. Il matraccio conico da 500 ml contenente 225 ml di soluzione salina, le 10 provette contenenti 9 ml di soluzione salina ciascuna e il matraccio conico da 1 litro contenente 500 ml di terreno agar nutriente vengono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

6. Dopo la sterilizzazione, i materiali sterilizzati vengono rimossi dall'autoclave e lasciati raffreddare per un po 'di tempo, senza consentire al terreno di solidificarsi. Il raffreddamento del mezzo impedisce la formazione di condensa e l'accumulo di gocce d'acqua all'interno delle piastre. Se il terreno è già stato preparato e solidificato durante lo stoccaggio, deve essere liquefatto riscaldando accuratamente finché non si scioglie completamente.

7. Per preparare le piastre di agar, prima che l'agar nutritivo sterilizzato si raffreddi e si solidifichi, in condizioni di fuso fuso caldo, viene versato in modo asettico nelle 6 piastre di Petri sterilizzate (circa 20 ml ciascuna), in modo che il mezzo fuso ricopra il fondo della capsula piatti completamente.

Quindi, le piastre sono coperte con i loro coperchi e lasciate raffreddare, in modo da solidificare il mezzo in esse. Il vapore acqueo che può condensare sulla superficie interna delle piastre e dei coperchi viene evaporato mantenendo le piastre e i coperchi in posizione capovolta in un incubatore a 37 ° C per circa 1 ora.

8. 25 g del campione solido (ad es. Carne di pesce / carne di ostriche / alimenti trasformati) sono omogeneizzati e pesati in 225 ml di soluzione salina sterilizzata (diluente) in modo asettico (Figura 6.7). Questo dà una diluizione 10 volte (diluizione = 10 -1 ). Per il campione liquido, 1 ml di campione viene pipettato asetticamente in una provetta salina sterilizzata da 9 ml. Questo dà anche una diluizione 10 volte (diluizione = 10 -1 ).

9. 1 ml della diluizione 10-1 viene trasferito a 9 ml di soluzione salina sterilizzata in un'altra provetta. Questo dà 100 volte la diluizione (diluizione = 10 -2 ). Dalla diluizione 10 -2, 1 ml viene lasciato cadere in una scatola di Petri sterilizzata e 0, 1 ml su una piastra di agar, dalla stessa pipetta. Per ogni diluizione viene utilizzata una pipetta sterilizzata separata. Dopo l'uso è immerso nel vaso di smaltimento.

10. 1 ml della diluizione 10 -2 viene trasferito a 9 ml di soluzione salina sterilizzata in un'altra provetta. Questo dà una diluizione 1000 volte (diluizione = 10 -3 ). Dalla diluizione 10 -3, 1 ml viene lasciato cadere in una capsula di Petri sterilizzata e 0, 1 ml su una piastra di agar, dalla stessa pipetta. In modo simile, la diluizione viene proseguita fino a 10 -6 in serie, ogni volta trasferendo 1 mi in una piastra di Petri sterilizzata e 0, 1 mi in una piastra di agar dalla stessa pipetta.

11. Quindi, le gocce di sospensione sulle piastre di agar vengono distribuite in modo asettico da un diffusore di vetro sterilizzato. Dopo la diffusione in ogni piastra, viene sterilizzato a fiamma immergendolo nell'alcool e mostrando su una fiamma. Questa è la "tecnica della piastra di diffusione".

12. Le capsule di Petri contenenti 1 ml di sospensione di batteri ciascuna vengono prese e viene versato in essi un agar nutriente liquefatto sterilizzato. Si muovono delicatamente, in modo da consentire alla sospensione di miscelarsi uniformemente con il mezzo. Le piastre sono lasciate raffreddare fino a quando il mezzo si solidifica. Questa è la "tecnica del piatto di versamento".

13. Quindi, le piastre vengono incubate in posizione capovolta, dall'alto verso il basso, a 37 ° C per 24 ore in un'incubatrice (Figura 6.7).

14. Una piastra di agar non inoculata viene incubata come controllo per garantire un'adeguata sterilizzazione, come mostrato da nessuna crescita su di esso.

osservazioni:

Il numero di colonie di batteri sulle piastre viene contato direttamente o con l'aiuto di un contatore di colonie del Quebec. Da questo, viene calcolato il numero di batteri presenti per grammo o ml del campione originale. Questo è chiamato enumerazione.

Regole di enumerazione:

1. Devono essere prese in considerazione le piastre di Petri da 30 a 300 colonie.

2. Il numero medio di duplicati e triplicati (R 1, R 2 R 3 ...) è considerato solo se un conteggio non supera il doppio dell'altro. Se uno è più del doppio dell'altro valore inferiore viene preso.

3. Per la tecnica della piastra di scorrimento, il conteggio batterico è No.X 10 c / gm, dove c = fattore di diluizione. Per la tecnica della piastra di diffusione, il numero di batteri è No. X10 c + 1 / gm, dove c = fattore di diluizione. Il numero viene convertito in due posizioni decimali sotto forma di (x.yz X 10 m ). Ad esempio, 288 X 10 4 è espresso come 2, 88 x 10 6 .

4. Se, in tutte le diluizioni, il numero di colonie è superiore a 300, contare per la massima diluizione e se in tutte le diluizioni è inferiore a 30, viene considerato il conteggio per la diluizione più bassa. In entrambi i casi il conteggio è rappresentato come: Numero stimato X 10 c / gm o ml per tecnica di piastra di versamento e Numero stimato X 10 c + 1 / gm o ml per tecnica di piastra di diffusione.

5. Se non viene osservata alcuna colonia in alcuna diluizione, è rappresentata come: Stima <1 x minima diluizione.

6. Poiché la diluizione seriale avviene in termini di 10 volte, matematicamente è ovvio che nessuna delle due diluizioni può avere colonie tra 30 e 300. Ad esempio, se 10 -3 ha 50 colonie, 10 -2 dovrebbe avere 500 (cioè> 300) e 10 -4 dovrebbero avere 5 (cioè <30) colonie.

Tuttavia, questo non si verifica in realtà, poiché i batteri non si presentano come una soluzione omogenea; piuttosto si verificano come una sospensione nei diluenti. Se ci sono due diluizioni con colonie numerabili (tra 30 e 300), calcolare prima il numero di unità formanti colonie / gm o ml usando ciascuna diluizione.

Se un valore è più del doppio dell'altro, riporta il valore più basso. In caso contrario, prendi la media dei due valori e riporta quel valore.