Coltivazione di batteri da campioni solidi, liquidi e tampone (con figura)

Scopo:

Gli scopi principali della coltivazione di batteri sono i seguenti:

1. Aumentare il numero di batteri, in modo da renderli in forme visibili, come colonie o sospensioni.

2. Isolamento di batteri.

3. Mantenimento della coltura pura e colture standard.

4. Enumerazione di batteri nei campioni.

5. Rilevazione di particolari batteri di interesse in un campione e sua enumerazione.

6. Identificazione dei batteri dalle caratteristiche della colonia, caratteristiche di crescita su slant e attività biochimiche in diversi media.

Tuttavia, lo scopo di questo esperimento è solo quello di coltivare batteri da campioni liquidi, solidi e di superficie in mezzi solidi e liquidi, in modo da renderli rispettivamente in forme visibili come colonie o sospensione.

Principio:

I batteri sono coltivati in terreni liquidi o solidi sterilizzati, ricchi di nutrimento. Il mezzo liquido, chiamato brodo, è contenuto in provette per formare "tubi di brodo", mentre il supporto solido, chiamato agar-media, è contenuto in piastre di Petri per formare "piatti di agar" o semplicemente "piatti". La coltivazione dei batteri ha bisogno di materiale, che si sospetta contenga batteri.

La maggior parte delle cose che vediamo contengono batteri. Sono presenti nei denti raschiatura, cibo, suolo, acqua, materiale fecale e persino nei mezzi microbiologici non sterilizzati stessi. Una quantità definita della sospensione omogenea di uno qualsiasi dei materiali contenenti batteri viene inoculata nel mezzo sterilizzato in modo asettico e incubata in un incubatore a 37 ° C per 24 ore.

In un brodo liquido, i batteri crescono come sospensione e la rendono torbida. Su piastre di agar solide crescono come colonie; ogni colonia cresce da un singolo batterio. La coltivazione dei batteri avviene nei seguenti cinque passaggi.

1. Preparazione dei media

2. Sterilizzazione di supporti e articoli di vetro

3. Inoculazione

4. Incubazione

5. Osservazione

1. Preparazione dei media:

Solitamente, in preparazione di brodo liquido e mezzi semisolidi, gli ingredienti vengono pesati nelle proporzioni prescritte e disciolti nella quantità d'acqua richiesta. Allo stato attuale, sono disponibili polveri di materiali pronti contenenti gli ingredienti nelle proporzioni richieste.

Nella preparazione di mezzi di brodo liquido, la quantità prescritta di polvere (come menzionato sull'etichetta del pacco) viene pesata e sciolta nella quantità richiesta di acqua in una beuta conica. Gli ingredienti vengono sciolti riscaldando, versati in provette e sterilizzati in autoclave.

Ma in preparazione di piastre solide, inclinati e tubi profondi, la quantità prescritta di polvere (come menzionato sull'etichetta del pacco) viene pesata e sciolta nella quantità necessaria di acqua in una beuta conica. Questo terreno preparato viene prima sterilizzato in autoclave e poi lasciato raffreddare per un po 'di tempo.

Mentre è ancora caldo, prima che si solidifichi, viene versato in piastre di Petri o provette sterilizzate e lasciato solidificare a temperatura ambiente. Il supporto, in condizioni molto calde, non deve mai essere versato nei contenitori, in quanto porta alla condensazione di acqua sulla parete dei contenitori, che cadono sulla superficie del supporto e possono portare alla sua contaminazione.

2. Sterilizzazione:

Le vetrerie vengono sterilizzate in forno ad aria calda a 180 ° C per 3 ore e il supporto in autoclave a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti. Glasswares può anche essere sterilizzato in autoclave, ma i supporti non devono mai essere sterilizzati nel forno, poiché l'acqua fuoriesce dal supporto e si disidrata.

3. Inoculazione:

Si presume che i campioni liquidi siano sospensioni omogenee di batteri. Pertanto, per la coltivazione in brodo, un volume definito del campione viene pipettato nel brodo in modo asettico. Per la coltivazione su piastre di agar, un volume definito del campione viene pipettato sulla piastra di agar solida e distribuito sulla superficie del terreno in modo asettico.

Per campioni solidi, un campione di peso definito viene omogeneizzato in modo asettico in un volume definito di normale soluzione fisiologica (0, 85% di cloruro di sodio) usando un mortaio o un frullatore sterilizzato. La maggior parte dei patogeni umani sono isotonici per il corpo umano (0, 85% di cloruro di sodio).

Di solito il rapporto tra campione e soluzione salina è 1: 9 (1 g + 9 ml, 10 g + 90 ml, 25 g + 225 ml o 50 g + 450 mi). Un volume definito di questo liquido omogeneizzato, che si presume essere una sospensione omogenea di batteri, viene pipettato in modo asettico al brodo sterilizzato in provette per la coltura di brodo. Per la coltura su piastre di agar, la sospensione liquida viene pipettata sulla superficie delle piastre e distribuita in modo asettico.

Per i campioni di superficie utilizzati per studiare la microbiologia delle superfici solide (piani dei tavoli, superfici del corpo o ferite), la superficie viene strofinata con un tampone sterilizzato. Il tampone viene toccato sulla superficie di una piastra di agar sterilizzata. Dal punto di vista del tatto, le strisce vengono fatte asetticamente in ciclo sterilizzato, in modo da isolare i batteri.

4. Incubazione:

Le provette e le piastre di brodo inoculato vengono incubate a 37 ° C per 24 ore in un incubatore.

5. Osservazione:

Torbidità in brodo liquido e colonie su piastre di agar indicano la crescita di batteri.

Materiale richiesto:

Piastre di Petri (6 n.), Pipette da 2 ml (5 n.), Provette (5 n.), Flaconi conici (100 ml, 250 ml e 500 ml-l ciascuno), becher da 250 ml (2 n.), Vetro spreader, astuccio per pipette in acciaio inossidabile, carta per mestiere, filo (o elastico), cotone non assorbente, bastoncini piccoli, cappio, alcool etilico, cloruro di sodio (NaCl), acido cloridrico 0, 1 N (HCI), idrossido di sodio 0, 1 N (NaOH ), acqua distillata, brodo nutriente, agar nutriente, campione liquido (ad esempio acqua dello stagno), campione solido (ad es. suolo), campione superficiale (ad es. tavolo, superficie corporea, ferita), carta pH (o pHmetro), pestello e malta (o omogenizzatore), bruciatore bunsen, forno ad aria calda, autoclave, incubatore, camera a flusso laminare.

Procedura:

1. Cinque pipette (in un contenitore per pipette in acciaio inossidabile), sei piastre di Petri e un paio di pestello e mortaio (o una tazza omogenea) vengono sterilizzate a 180 ° C per 3 ore in un forno ad aria calda. In alternativa, possono essere coperti con carta artigianale, legati con filo o elastico e sterilizzati in autoclave insieme al supporto (Figura 6.1).

2. 0, 85 g di NaCl vengono sciolti in 100 ml di acqua distillata in un becher da 250 ml e 90 ml di questa soluzione salina vengono versati in un matraccio conico da 100 ml. La bocca è ricoperta di cotone, coperta con carta artigianale e legata con filo o elastico.

3. Gli ingredienti del mezzo di brodo nutriente richiesto per 100 ml di brodo vengono pesati. In alternativa, viene pesata la quantità prescritta di polvere di brodo nutriente pronta (miscela di ingredienti).

4. Gli ingredienti (o la polvere pronta) vengono sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml agitandoli e agitandoli. Il suo pH è determinato usando una carta pH o un pH metro. Il pH è regolato a 7, 0 usando 0, 1 N HCI se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore. Il pallone viene riscaldato, se necessario, per sciogliere completamente gli ingredienti.

5. Il brodo viene distribuito in 5 provette (circa 10 ml ciascuna), le loro bocche cotte in cotone, coperte con carta artigianale e legate con filo o elastico.

6. Gli ingredienti del terreno di agar nutritivo o della sua polvere pronta per il fabbisogno per 200 ml del mezzo vengono pesati e sciolti in 200 ml di acqua distillata in una beuta da 500 ml agitandoli e agitandoli.

Il suo pH viene determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 0 usando HC1 0, 1 N se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno. Quindi, è coperto di cotone, coperto con carta artigianale e legato con filo o elastico.

7. I tamponi sono fatti torcendo il cotone attorno alle punte dei bastoncini. Pochi di questi tamponi vengono tenuti in una provetta con le punte di cotone rivolte verso il basso. La provetta è rivestita in cotone, coperta con carta artigianale e legata con filo o elastico.

8. La beuta da 100 ml con 90 ml di soluzione salina, le 5 provette con brodo nutriente, la beuta da 500 ml contenente 200 ml di terreno agar nutriente e la provetta contenente i tamponi vengono sterilizzate a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

9. Dopo la sterilizzazione, i materiali sterilizzati vengono rimossi dall'autoclave e lasciati raffreddare per un po 'di tempo, senza consentire al terreno di solidificarsi. Il raffreddamento del mezzo impedisce la formazione di condensa e l'accumulo di gocce d'acqua all'interno delle piastre. Se il terreno è già stato preparato e solidificato durante lo stoccaggio, deve essere liquefatto riscaldando accuratamente finché non si scioglie completamente.

10. Per preparare le piastre di agar nutrienti, prima che l'agar nutritivo sterilizzato si raffreddi e si solidifichi, in condizioni di fuso caldo, viene versato in modo asettico nelle 6 piastre di Petri sterilizzate (circa 20 ml ciascuna), in modo che il mezzo fuso copra il fondo di le piastre di Petri completamente.

Quindi, le piastre sono coperte con i loro coperchi e lasciate raffreddare, in modo da solidificare il mezzo in esse. Il vapore acqueo che può condensare sulla superficie interna delle piastre e dei coperchi viene evaporato mantenendo le piastre e i coperchi in posizione capovolta in un incubatore a 37 ° C per circa 1 ora.

11. Viene prelevato il campione liquido (sospettato di contenere batteri, ad es. Acqua di stagno). Un ml di ciascuno dei campioni è pipettato asetticamente in 2 tubi di brodo (Figura 6.2). I tubi sono roteati. Il campione liquido viene anche pipettato in modo asettico su 2 piastre di agar, 0, 1 ml ciascuna, e distribuito sulla superficie del mezzo agar utilizzando un diffusore di vetro sterilizzato a fiamma.

Prima di ogni spargimento dal diffusore di vetro, è immerso in alcool e fiammeggiato su un bunsen. Le provette e le piastre di brodo inoculato vengono incubate a 37 ° C per 24 ore in un incubatore. Le piastre sono incubate in posizione capovolta, dall'alto verso il basso.

12. Per il campione solido (ad es. Suolo), 10 g del campione vengono pesati asetticamente e omogeneizzati nella tazza sterilizzata a forma di pestello e mortaio o omogeneizzatore dopo aver aggiunto 90 ml della soluzione salina sterilizzata dalla beuta da 100 ml.

Questa sospensione di batteri omogenea viene pipettata asetticamente in 2 provette di brodo e 2 piastre di agar come nella fase 11 e incubata a 37 ° C per 24 ore nell'incubatrice (Figura 6.2). Le piastre sono incubate in posizione capovolta, dall'alto verso il basso.

13. Per il campionamento superficiale, la superficie sospettata di contenere batteri (superficie del tavolo, superficie corporea, ferita) è contrassegnata per un'area unitaria (ad es. 1 cm ² ), che viene strofinata con un tampone sterilizzato. Il tampone viene toccato sulla superficie dei due piatti di agar rimasti fuori.

Lo striatura viene eseguita in modo asettico da un circuito sterilizzato a fiamma. Per striature, le linee quasi parallele vengono disegnate dal loop dal punto di contatto del tampone. Questi formano le strisce primarie. Dopo la sterilizzazione a fiamma del circuito, le strisce secondarie vengono disegnate quasi in diagonale rispetto alle strisce primarie. Allo stesso modo, le strisce terziarie e quaternarie sono fatte in modo asettico.

14. Quindi, le piastre vengono incubate in posizione capovolta, dall'alto verso il basso, a 37 ° C per 24 ore nell'incubatore (Figura 6.2).

15. Una piastra di agar non inoculata e una provetta di brodo non inoculato vengono incubate come controllo per garantire un'adeguata sterilizzazione come indicato dall'assenza di crescita in esse. Questo passaggio è facoltativo.