DNA Fingerprinting: principi e tecniche del DNA Fingerprinting

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Aspetto storico:

Lo studio delle impronte di dita, palme e suole si chiama dermatoglifi.

Cortesia dell'immagine: www2.wmin.ac.uk/~redwayk/lectures/images/DNA_fingerprinting_01.jpg

È stato oggetto di interesse umano fin dai tempi primitivi in ​​cui l'uomo era solito cacciare il suo cibo con l'aiuto delle impronte di animali. La scienza delle impronte digitali fu usata per la prima volta da Sir William Herschel come metodo di identificazione nel 1858. In India la scienza delle impronte digitali fu scoperta per caso durante un'indagine per omicidio a Jalpaiguri nel 1897.

Alec Jeffreys (1984) ha inventato la tecnica del DNA fingerprinting presso la Leicester University, nel Regno Unito. Il Dr. VK Kashyap e il Dr. Lalji Singh hanno iniziato la tecnologia di DNA fingerprinting in India presso il CCMB (Center for Cell and Molecular Biology) di Hyderabad.

Cos'è il DNA-fingerprinting?

Fingerprinting del DNA (detto anche DNA typing o DNA profiling). È una tecnica per determinare sequenze nucleotidiche di certe aree del DNA che sono uniche per ogni individuo. Ogni persona ha un'impronta digitale di DNA univoca.

A differenza di un'impronta digitale convenzionale che si verifica solo sulla punta delle dita e può essere modificata chirurgicamente, un'impronta digitale del DNA è la stessa per ogni cellula, tessuto e organo di una persona. Non può essere modificato da nessun trattamento conosciuto. Il modo ideale per distinguere un individuo - da altre persone sarebbe la sua intera sequenza genomica di DNA.

Principio di DNA Fingerprinting:

Con le loro differenze, circa lo 0, 1% o 3 x 10 ⁶ paia di basi (su 3 x 10 ⁹ bp) forniscono individualità a ciascun essere umano. Il genoma umano possiede numerose piccole sequenze di basi non codificanti ma ereditabili che vengono ripetute molte volte. Queste sequenze si verificano vicino a telomeri, centromeri, cromosoma Y ed area eterocromatica. L'area con la stessa sequenza di basi ripetuta più volte si chiama DNA ripetitivo.

Possono essere separati come satellite dal bulk DNA durante la centrifugazione con gradiente di densità e quindi chiamato DNA satellite. Nel DNA satellitare, la ripetizione delle basi è in tandem. A seconda della lunghezza, della composizione di base e del numero di unità ripetitive tandem, i DNA satellite hanno sottocategorie come microsatelliti e mini-satelliti. I DNA satellitari mostrano il polimorfismo. Il termine polimorfismo viene utilizzato quando una variante in un locus è presente con una frequenza superiore a 0, 01 della popolazione.

Le variazioni si verificano a causa di mutazioni. Mentre le mutazioni nei geni producono alleli con espressioni diverse, le mutazioni nel DNA ripetitivo non codificante non hanno alcun impatto immediato.

Queste mutazioni nelle sequenze non codificanti si sono accumulate nel tempo e costituiscono la base del polimorfismo del DNA (la variazione a livello genetico deriva dalle mutazioni). Il polimorfismo del DNA è alla base della mappatura genetica del genoma umano e della stampa del DNA.

Le brevi ripetizioni del nucleotide nel DNA sono molto specifiche in ogni individuo e variano in
numero da persona a persona ma sono ereditati. Queste sono le 'ripetizioni in tandem di numeri variabili' (VNTR). Questi sono anche chiamati "minisatelliti". Ogni individuo eredita queste ripetizioni dai suoi genitori che sono usati come marcatori genetici in un test di identità personale.

Ad esempio (Fig. 6.39), un bambino potrebbe ereditare un cromosoma con sei ripetizioni in tandem dalla madre e lo stesso tandem ripetuto quattro volte nel cromosoma omologato ereditato dal padre. Una metà degli alleli VNTR del bambino assomiglia a quella della madre e dell'altra metà a quella del padre.

Tecnica per il DNA Fingerprinting (Fig. 6.40):

(i) Il DNA viene estratto dai nuclei dei globuli bianchi o degli spermatozoi o delle cellule dei follicoli piliferi che si aggrappano alle radici dei peli caduti o tirati fuori.

(ii) Le molecole di DNA vengono prima spezzate con l'aiuto dell'endonucleasi della restrizione enzimatica (chiamato coltello chimico) che le taglia in frammenti. I frammenti di DNA contengono anche i VNTR.

(iii) I frammenti sono separati in base alla dimensione mediante elettroforesi su gel.

(iv) Frammenti di una particolare dimensione aventi VNTR sono moltiplicati tramite tecnica PCR. Sono trattati con sostanze chimiche alcaline per dividerli in DNA a filamento singolo.

(v) I frammenti separati di DNA a filamento singolo vengono trasferiti su una membrana di nylon.

(vi) Le sonde radioattive di DNA con sequenze di basi ripetute complementari a possibili VNTR vengono versate sulla membrana di nylon. Alcuni di essi si collegheranno ai VNTR single-strand. Il metodo di ibridazione del DNA con sonde si chiama Southern Blotting, dopo il nome dell'inventore, EM Southern (1975). La membrana in nylon viene lavata per rimuovere le sonde extra.

(vii) Un film a raggi X viene esposto alla membrana di nylon per marcare i punti in cui le sonde di DNA radioattivo si sono legate ai frammenti di DNA. Questi luoghi sono contrassegnati come bande scure quando viene sviluppata una pellicola radiografica. Questo è noto come autoradiografia.

(viii) Le bande scure sul film a raggi X rappresentano le impronte digitali del DNA (= profili DNA).

Applicazioni del DNA Fingerprinting:

(i) Individualità:

Come la stampa con le dita della pelle (dertropuscoli), le impronte digitali del DNA possono aiutare a distinguere un essere umano da un altro con l'eccezione dei gemelli monozigoti,

(ii) Controversie di paternità / maternità:

Le impronte digitali del DNA possono identificare la vera madre genetica, il padre e la prole,

(iii) Lignaggio umano:

Il DNA di vari probabili è in fase di studio per scoprire il lignaggio umano,

(iv) Malattie ereditarie:

La tecnica viene utilizzata per identificare i geni connessi a malattie ereditarie,

(v) Forensics:

L'impronta digitale del DNA è molto utile nel rilevamento di reati e attività legali. Le impronte digitali del DNA hanno dimostrato che Dhanu, la bomba umana, era il vero assassino di Shri Rajiv Gandhi, l'ex Primo Ministro dell'India,

(vi) Sociologia:

Può identificare i gruppi razziali, la loro origine, le migrazioni storiche e le invasioni. La genografia è lo studio della storia migratoria delle specie umane.