Replicazione del DNA: note sulla replicazione del DNA, riparazione e ricombinazione
Note sulla replicazione del DNA, riparazione e ricombinazione!
Replicazione del DNA:
Replicazione semi-conservativa del DNA:
La replicazione del DNA è una funzione autocatalitica del DNA. Di solito si verifica durante la fase S del ciclo cellulare quando i cromosomi sono in forma molto estesa. Come proposto da Watson e Crick, la replicazione del DNA è semi-conservativa.
Nella replicazione semi-conservativa, i due filamenti si separerebbero l'un l'altro, manterrebbero la loro integrità e ciascuno sintetizzerebbe, dal pool di nucleotidi, il suo filamento complementare. Il risultato sarebbe che la molecola appena sintetizzata porterebbe o conservasse uno dei due filamenti dalla molecola madre e l'altro filamento sarebbe stato appena assemblato. Esistono prove sufficienti per dimostrare che il DNA a doppio filamento si replica realmente con il metodo semi-conservativo.
Meselson and Stahl's Experiment (1958):
Questi lavoratori coltivarono l'Escherichia coli in un terreno contenente 15 isotopi di N. Dopo che questi erano stati replicati per alcune generazioni in quel terreno, entrambi i filamenti di questo DNA contenevano 15 N come costituenti di purine e pirimidine. Quando questi batteri con 15 N sono stati trasferiti in un terreno di coltura contenente 14 N, è stato scoperto che il DNA separato dalla nuova generazione di batteri possiede un filamento più pesante dell'altro.
Il filamento più pesante rappresenta il filamento parentale e uno più leggero è il nuovo sintetizzato dal mezzo di coltura, indicando quindi un metodo semi-conservativo di replicazione del DNA ed escludendo sia modelli conservativi che dispersivi di sintesi e replicazione del DNA.
La replicazione conservativa non produrrebbe alcuna molecola di DNA con una costituzione "ibrida". Se la replicazione fosse dispersiva, ci sarebbe stato uno spostamento del DNA da "pesante verso" luce "attraverso ogni generazione.
Successivi studi hanno verificato la conclusione di Meselson e Stahl secondo cui la replicazione del DNA è semi-conservativa e l'ha estesa a molti altri organismi, comprese piante e animali superiori.
L'esperimento di autoradiografia di Cairn:
Ha usato timina radioattiva o timidina triziata. Con la crescita di E. coli in un terreno di coltura contenente timidina triziata, la radioattività è stata incorporata nelle molecole di DNA figlia.
Nell'autoradiografia la molecola di DNA duplicante mostra una forcella replicante, il punto in cui due catene diventano quattro. Dopo la prima replicazione, si vede che la radioattività è incorporata in uno solo dei filamenti di DNA ed entrambi i filamenti sono identificati dopo la seconda replicazione. Questo supporta le modalità semi-conservative della replicazione del DNA.
Gli esperimenti di JH Taylor sui suggerimenti per radici di Viciafaba (1957) confermano anche il metodo semi-conservativo della replicazione del DNA.
io. Replicazione discontinua del DNA:
Okazaki ha suggerito che la sintesi del DNA procede simultaneamente su entrambi i filamenti di DNA utilizzando lo stesso enzima DNA polimerico sotto forma di piccoli frammenti isolati. Questi segmenti sono noti come pezzi di Okazaki e consistono di 1000-2000 nucleotidi. Questi sono uniti dall'enzima polinucleotide ligasi, completando la formazione della catena polinucleotidica.
La sintesi discontinua del DNA è supportata dall'esperimento auto-radiografico.
ii. Replicazione unidirezionale e bidirezionale del DNA:
J. Cairns dai suoi esperimenti ha concluso che la sintesi del DNA inizia in un punto fisso sui cromosomi e procede in una direzione, ma esperimenti recenti suggeriscono una replicazione bidirezionale.
Levinthal e Cairns proposero che durante la replicazione, i due filamenti non si separassero completamente prima della replicazione. Invece iniziano a decomprimere ad una estremità e contemporaneamente i segmenti decompressi iniziano ad attrarre le loro coppie nucleotidiche. In questo modo la decompressione dei filamenti originali del DNA e la sintesi di nuovi filamenti di DNA vanno fianco a fianco.
DNA polimerasi:
La DNA polimerasi è il principale enzima della replicazione del DNA. La sua attività fu dimostrata per la prima volta da Kornberg nel 1956. Catalizza l'aggiunta covalente di deossiribonucleotidi al 3'-OH di un pre-esistente nucleotide chiamato primer.
L'enzima DNA polimerasi-1 è ora considerato un enzima di riparazione del DNA piuttosto che un enzima di replicazione. Questo enzima è noto per avere cinque siti attivi, vale a dire sito modello, sito di primer, 5 '-> 3' sito di scissione o esonucleasi, sito di nucleoside trifosfato e sito di scissione 3 '-> 5' (o sito di exonucleasi 3 '-> 5' ).
DNA polimerasi I:
È principalmente coinvolto nella rimozione di primer di RNA da Okazaki o frammenti di precursori e nel riempire gli spazi risultanti grazie alla sua capacità di polimerizzazione di 5 '-> 3'. L'enzima DNA polimerasi I può anche rimuovere i dimeri di timina prodotti a causa dell'irradiazione UV e colmare il vuoto dovuto all'asportazione. Questa è chiamata funzione di lettura o modifica di questo enzima.
DNA polimerasi II:
Questo enzima assomiglia alla DNA polimerasi I nella sua attività, ma è un enzima di riparazione del DNA e determina la crescita in direzione 5 '-> 3', utilizzando gruppi 3'-OH liberi.
DNA polimerasi-III:
Svolge un ruolo essenziale nella replicazione del DNA. È un enzima multimerico o un oloenzima con dieci subunità come α, β, ε, θ, г, y, δ, δ ', x e Ψ. Tutte queste dieci subunità sono necessarie per la replicazione del DNA in vitro; tuttavia, tutti hanno funzioni diverse. Ad esempio, la subunità α ha un'attività di rilettura o modifica exonuclease da 3 '-> 5'. L'enzima core comprende tre subunità-α, β e θ. Le restanti sette subunità aumentano la processività (processività significa rapidità ed efficienza con cui una DNA polimerasi estende la catena di crescita).
DNA polimerasi eucariotica:
Gli eukai yote (es. Lievito, fegato di ratto, cellule tumorali umane) contengono i seguenti cinque tipi di DNA polimerasi:
(i) DNA polimerasi a:
Questo enzima a peso molecolare relativamente alto è anche chiamato polimerasi citoplasmatica o polimerasi grande. Si trova sia nel nucleo che nel citoplasma.
(ii) DNA polimerasi β:
Questo enzima è anche chiamato polimerasi nucleare o piccola polimerasi e si trova solo nei vertebrati.
(iii) DNA polimerasi y:
Questo enzima è chiamato polimerasi mitocondriale ed è codificato nel nucleo.
(iv) DNA polimerasi δ:
Questo enzima si trova in cellule di mammifero ed è dipendente da PCNA per la processività di sintesi del DNA (PCNA = antigene nucleare cellulare proliferante).
(v) DNA polimerasi ε:
Precedentemente era noto come DNA polimerasi 5II. Questo enzima è indipendente dal PCNA e si trova nelle cellule HeLa dei mammiferi e nel lievito in erba.
La grande DNA polimerasi a è l'enzima DNA polimerasi predominante è cellule eucariotiche e per lungo tempo è stato ritenuto l'unico enzima coinvolto nella replicazione del DNA. Ma ora un'altra polimerasi, vale a dire la DNA polimerasi 8, è anche coinvolta nella replicazione del DNA eucariotico.
Primer del DNA:
Questi enzimi catalizzano la sintesi dei primer dell'RNA, che sono un prerequisito per l'inizio della replicazione del DNA nella stragrande maggioranza degli organismi. Prima dell'effettiva replicazione del DNA, i segmenti di oligonucleotidi RNA corti, chiamati primer RNA o semplicemente i primer, devono essere sintetizzati dall'enzima primasi del DNA utilizzando i ribosucleosidi trifosfati.
Questo primer di RNA viene sintetizzato copiando una particolare sequenza di basi da un filamento di DNA e differisce da una tipica molecola di RNA in quanto dopo la sintesi il primer rimane legato all'idrogeno alla dima del DNA.
I primer sono lunghi circa 10 nucleotidi negli eucarioti e sono fatti ad intervalli sul filo ritardato dove sono allungati dall'enzima DNA polimerasi per iniziare ogni frammento di okazaki. Questi primer di RNA vengono successivamente asportati e riempiti di DNA con l'aiuto del sistema di riparazione del DNA negli eucarioti.
Nei batteri, sono noti due diversi enzimi per sintetizzare primer oligonucleotidi dell'RNA - RNA polimerasi (sul filamento principale) e primasi del DNA (sul filamento in ritardo).
Ligasi polinucleotidica:
Questo enzima è un enzima importante sia nella replicazione del DNA che nella riparazione del DNA. La ligasi del DNA catalizza la formazione del legame fosfodiestere tra il gruppo 5'-fosforile di un nucleotide e il gruppo 3-OH del vicino immediato sul lato di un nick in un filamento di DNA; quindi sigilla le tacche in un filamento di DNA.
endonucleasi:
Le endonucleasi, in particolare le endonucleasi di restrizione, sono importanti anche durante la replicazione del DNA e la riparazione del DNA. Durante la replicazione del DNA, un endounclease può produrre un nick nell'origine per iniziare la replicazione o può indurre nick a generare un girello per facilitare lo svolgimento del DNA.
Enzimi coinvolti nell'apertura dell'elica del DNA:
Eliche di DNA:
Le eliche del DNA sono enzimi svolgenti dipendenti dall'ATP che promuovono la separazione dei due fili parentali e stabiliscono forcelle di replicazione che si allontaneranno progressivamente dall'origine. Lo svolgimento del modello di elica del DNA su una forcella di replicazione potrebbe essere in linea di principio catalizzato da due eliche di DNA, che agiscono di concerto, una che corre lungo il filo principale e l'altra lungo il filo in ritardo.
Striscia destabilizzante dell'elica (chiamata anche proteine a legamento del DNA a singolo filamento o SSBP):
Dietro la forcella di replicazione, i singoli filamenti di DNA sono impediti dal riavvolgimento reciproco (o dalla formazione di anelli a doppio capello in ogni singolo filamento) dall'azione delle proteine SSB. Le proteine SSB si legano ai filamenti di DNA esposti senza coprire le basi, che rimangono quindi disponibili per il processo di costruzione.
Topoisomerasi (DNA girasi):
L'azione di un helicase introduce un supercoil positivo nel DNA duplex davanti alla forcella di replicazione. Gli enzimi, chiamati topoisomerasi, rilassano il supercoil attaccandolo al transientemente supercoil duplex, intaccando uno dei fili e ruotandolo attraverso il filo ininterrotto. Il nick viene quindi risigillato.
Un tipo di topoisomerasi (cioè topoisomerasi I) causa una rottura o un nick a singolo filamento che consente alle due sezioni dell'elica del DNA su entrambi i lati del nick di ruotare liberamente l'una rispetto all'altra, usando il legame fosfodiestere nella parte opposta del nick come un punto di riferimento. Un secondo tipo di topoisomerasi (cioè topoisomerasi II) forma contemporaneamente un legame covalente con entrambi i filamenti dell'elica del DNA, creando una rottura transitoria del doppio filamento nell'elica.
Replicon:
Un replicone è l'unità del DNA in cui avvengono i singoli atti di replicazione, cioè è in grado di replicare il DNA indipendentemente da altri segmenti di DNA. Pertanto, ogni replica ha un'origine in cui viene avviata la replica e può avere un capolinea a cui si ferma la replica.
I cromosomi batterici e virali di solito contengono un singolo replicone / cromosoma. Sebbene il fago T, abbia due origini, una primaria e una secondaria, ma in presenza di origine primaria l'origine secondaria è, di norma, non funzionale. In E. coli il punto di origine è identificato come luogo genetico oriC.
Un'origine procariotica completa supporta le seguenti tre funzioni: (1) inizio della replicazione, (2) controllo della frequenza degli eventi di iniziazione e (3) la segregazione dei cromosomi replicati nelle cellule figlie.
Le origini sono state identificate in batteri, lieviti, cloroplasti e mitocondri; la loro caratteristica generale significativa è che sono ricchi di A: T che possono essere importanti per facilitare lo svolgimento durante la replica. L'origine batterica contiene molti siti brevi (<10 bp) necessari per la sua funzione; questi siti sono talvolta separati da distanze specifiche ma non da sequenze specifiche. Questi siti specificamente localizzati sono necessari per il legame di diverse proteine coinvolte nella replicazione del DNA.
Diversi repliconi procarioti hanno siti specifici, chiamati terminus, che fermano il movimento della forcella di replicazione e, quindi, terminano la replicazione del DNA. Il cromosoma di E. coli ha due terminali, chiamati T 1 e T 2 situati a circa 100 Kb su entrambi i lati del punto in cui i fork di replica si incontrano. Ogni capolinea è specifico per una direzione del movimento della forcella.
Le T 1 e T 2 sono disposte in modo tale che ciascuna forcella debba passare l'altra per raggiungere il capolinea ad essa specifico. La terminazione della replicazione richiede il prodotto del gene tus, che probabilmente codifica per una proteina che riconosce T e T 2 .
Negli eucarioti, ciascun cromosoma ha diversi repliconi (ad esempio, lievito, 500; Drosophila, 3.500; mouse 25.000; Viciafaba, 35.000). Ad un certo punto durante la fase S, solo alcuni di questi repliche subiscono la replica; ogni replicone sembra essere attivato in un momento specifico in una sequenza specifica. La lunghezza di un replicone eucariotico può variare da 40 Kb in lievito e Drosophila a circa 300 Kb in Vicia.
Il numero di repliconi rilevabili sembra variare con lo stadio di sviluppo e il tipo di cellula o tessuto. Ciò è spiegato sulla base delle origini specifiche dei tessuti, in modo che alcune origini siano attive in alcuni tessuti, mentre altre sono attive in altri tessuti.
Questo è esemplificato dalla Drosophila in cui le prime cellule embrionali hanno 10 volte più repliche di quelle nelle cellule somatiche adulte. Le prove disponibili suggeriscono che i repliconi eucariotici non hanno i terminalii.
Fedeltà della replica:
Il tasso di errore della replicazione del DNA è molto più basso di quello della trascrizione a causa della necessità di preservare il significato del messaggio genetico da una generazione all'altra. Ad esempio, il tasso di mutazione spontanea in E. coli è circa un errore per 10 10 basi incorporate durante la replicazione.
Ciò è dovuto principalmente alla presenza delle forme tautomeriche minori delle basi che hanno alterato le proprietà di accoppiamento di base. Il tasso di errore è ridotto al minimo da una varietà di meccanismi. Le DNA polimerasi incorporeranno solo un nucleotide entrante se formano la coppia di basi corretta con il nucleotide modello nel suo sito attivo.
L'errore occasionale viene rilevato dall'esonucleasi 3 '-> 5' rilegata associata alla polimerasi. Questo rimuove il nucleotide errato dall'estremità 3 'prima di ogni ulteriore incorporazione, consentendo alla polimerasi di inserire la base corretta. Affinché l'exonuclease funzioni correttamente, deve essere in grado di distinguere una coppia di basi corretta da una errata.
L'aumento della mobilità delle coppie di basi "non tenute in equilibrio" all'estremità 5 'dei frammenti di DNA in ritardo di nuova costituzione significa che non possono mai apparire corretti e quindi non possono essere corretti. Quindi, i primi pochi nucleotidi sono ribonucleotidi (RNA) in modo che possano essere successivamente identificati come materiale a bassa fedeltà e sostituiti con DNA allungato (e riletto) dal frammento adiacente. Gli errori che sfuggono alla correzione di bozze vengono corretti da un meccanismo di riparazione di disallineamento.
Meccanismo della replicazione del DNA nei procarioti:
La replicazione in vitro del DNA è stata ampiamente studiata in E. coli e nei fagi e nei plasmidi di E. coli. In E. coli, il processo di replicazione del DNA coinvolge i seguenti tre passaggi principali:
1. Iniziazione della replicazione del DNA:
Questo processo comprende tre fasi: (i) riconoscimento dell'origine (O), (ii) apertura del DNA duplex per generare una regione di DNA a singolo filamento e (iii) acquisizione di proteina Dna B (cioè 5 '3' elicasi funge anche da attivatore delle primase). Quindi, il complesso di ATP Dna-A (o proteina iniziatore) si lega a 9 bp di regioni di ripetizione invertita (R,, R,, R v R 4 ) di ori C di E. coli e promuove l'apertura del duplex del DNA in una regione di tre ripetizioni dirette della sequenza 13-bp (chiamate 13-mers).
L'apertura si verifica da destra 13-mer verso sinistra e richiede DNA negativamente sovrapposto e proteine dell'iniziatore IH o IHF. Il DNA B (-elicasi) viene trasferito al DNA a filamento singolo esposto e provoca lo srotolamento del DNA in presenza di A TP, proteina SSB e DNA girasi (una topoisomerasi).
Ciò si traduce nello srotolamento del duplex del DNA e della replicazione dai proventi ori C in entrambe le direzioni (bidirezionale); Il legame SSB si verifica su regioni a filamento singolo e due complessi di DNA B (= primosomi) vengono caricati uno su ciascun filo.
2. Allungamento della catena del DNA:
Questo passaggio richiede la presenza dei seguenti enzimi e fattori: 1. Dna B o helicase (anche chiamato promotore mobile); 2. primasi (Dna G); 3. DNA polimerasi holoenzyme (o DNA pol III HE); 4. Proteina SSB; 5. RNAasi H che rimuove i primer di RNA; 6. DNA polimerasi I che viene utilizzato per riempire il vuoto creato a causa di primer RNA e 7. DNA ligasi (che converte i frammenti okazaki senza primer in filo continuo). Durante l'avvio alla transizione di allungamento, si verificano i seguenti eventi:
(i) Quando helicase (o Dna B) viaggia in direzione 5 '-> 3', genera una forcella di replicazione aprendo il duplex del DNA.
(ii) Il filamento di DNA avente helicase diventa il filo in ritardo. La primasi del DNA si associa con l'elicasi del DNA B, formando il primosoma che sintetizza più primer per il filo in ritardo e primer singolo RNA per il filo principale.
(iii) Per la sintesi del filo in ritardo, il DNA pol III HE deve lavorare sullo stesso filamento a cui è legata l'elicasi del Dna B, ma viaggia in direzione opposta.
(iii) l'elicasi di DnaB, la Dna Gprimase e la DNA III III FIE lavorano insieme in allungamento del filamento. Il complesso di elicasi e DNA polimerasi rimane processivo, cioè rimangono strettamente legati alla forcella e rimangono legati durante la reazione.
La sintesi (allungamento) dei fili ritardanti e principali avviene con metodi alquanto diversi; è molto più complesso per il filo in ritardo che per il filo conduttore:
(A) Sintesi discontinua su filo ritardato:
1. La primasi viene prelevata dalla soluzione e viene attivata dall'elicasi (DnaB) per sintetizzare il primer aRNA (da 10 a 20 nt o nucleotidi a lungo) sul filamento in ritardo.
2. I primer dell'RNA sono riconosciuti da DNA pol III HE sul filamento in ritardo e sono utilizzati per la sintesi di frammenti precursori o okazaki. Infatti, ogni nuovo primer RNA è riconosciuto dalla subunità gamma (y) di DNA pol III HE e caricato con subunità p della stessa polimerasi. Questa subunità p precaricata può quindi catturare il nucleo di DNA poly III HE quando diventa disponibile dopo aver terminato il suo lavoro sintetico sul precedente frammento di okazaki.
3. Al completamento dei frammenti di okazaki, i primer di RNA vengono asportati dalla DNA polimerasi 1, che quindi colma gli spazi vuoti risultanti con il DNA.
4. Dopo che la DNA polimerasi I aggiunge i desossiribonucleotidi finali nello spazio lasciato dal primer asportato, l'enzima DNA ligase emette il legame fosfodiestere che collega l'estremità libera del 3 'del primer alla estremità 5' del frammento di okazaki.
(B) Sintesi continua su filo principale:
1. Nella replicazione bidirezionale del DNA, il filo principale viene innescato una volta su ciascuno dei filamenti parentali.
2. Il primer RNA del filamento principale è sintetizzato dall'enzima RNA polimerasi.
3. Il DNA pol III HE provoca l'allungamento del filo principale e infine gli enzimi DNA pol 1 e ligasi danno il tocco finale al filo principale come nel caso del filo ritardato.
Replicazione del DNA negli eucarioti :
La replicazione del DNA eucariotico richiede due diversi enzimi DNA polimerasi, vale a dire DNA polimerasi a e DNA polimerasi δ. La DNA polimerasi δ sintetizza il DNA sul filamento principale (sintesi continua del DNA), mentre la DNA polimerasi sintetizza il DNA sul filamento in ritardo (sintesi del DNA discontinua). Oltre a questi due enzimi, la replicazione del DNA: (1) antigene T; (2) fattore di replicazione A o RF-A (chiamato anche RP-A o SSB eucariotico); (3) topoisomerasi I; (4) topoisomerasi II; (5) proliferante - antigene nucleare cellulare (PCNA, detto anche ciclina) e (6) fattore di replicazione Cor RF-C.
Il processo di replicazione del DNA eucariotico prevede i seguenti passaggi:
1. Prima della comparsa della sintesi del DNA, esiste una fase presintetica di 8-10 minuti per la formazione del complesso del DNA svolto. Questo passaggio richiede solo tre proteine purificate, cioè l'antigene T (T-ag o antigene tumorale), RF-A e topiosomerasi I e II.
2. L'antigene T, utilizzando il suo dominio di legame al DNA, forma un complesso multi-subunità con il sito I e il sito II in presenza di TP e ha causato lo srotolamento locale.
3. Svolgimento del duplex più esteso a causa dell'associazione di RF-A e di una topoisomerasi con - l'aiuto della componente di elicasi di DNA di Topoisomerasi T-fa aiuta a sciogliere il DNA alterando la topologia del DNA nella forcella di replicazione.
4. Le proteine RF-A o SSB si legano al DNA non tessuto a singolo filamento.
5. La sintesi dell'RNA dell'innesco viene eseguita dalla primasi che è strettamente associata alla DNA polimerasi ex.
6. La DNA polimerasi aiuta nella sintesi di un frammento di okazaki nella direzione da 5 'a 3'.
7. Il fattore di replicazione C (o RF-C) e il PCNA (ciclina) aiutano nella commutazione delle DNA polimerasi in modo tale che pol a venga sostituito da pol 5 che quindi sintetizza continuamente DNA sul filamento principale.
8. Un altro frammento di okazaki viene quindi sintetizzato dalla forcella di replicazione sul filamento ritardato dal complesso pol a - primasi e questo passaggio viene ripetuto ancora e ancora, fino a coprire l'intera molecola di DNA.
9. I primer dell'RNA vengono rimossi e gli spazi vengono riempiti come nella replicazione del DNA procariotico.
Recentemente, è stato sottolineato il ruolo della DNA polimerasi e nella replicazione del DNA, così che tre DNA polimerasi (a, δ e ε) sono ora note per essere coinvolte nella replicazione del DNA eucariotico. A. Sugino e colleghi hanno proposto che la DNA polimerasi possa funzionare sia nei filamenti principali che in quelli ritardati (poiché la polimerasi a ha attività α primasi), mentre la polimerasi e la polimerasi 5 sono coinvolte rispettivamente nell'allungamento dei filamenti di testa e di coda.
Danno del DNA e meccanismo di riparazione
Tipi di danni al DNA:
1. Lesioni di DNA:
Un'alterazione nella normale struttura chimica o fisica del DNA è definita come lesioni del DNA. Molti agenti esogeni, come sostanze chimiche e radiazioni, possono causare cambiamenti nelle posizioni degli atomi di azoto e di carbonio nei sistemi ad anello eterociclico delle basi e in alcuni dei gruppi funzionali esociclici (cioè i gruppi cheto e amminico delle basi).
Ciò può portare alla perdita dell'accoppiamento di basi o all'accoppiamento di basi alterato (ad esempio una coppia di basi A alterata con C invece di T). Se una tale lesione è permessa di rimanere nel DNA, una mutazione può essere fissata nel DNA mediante mutagenesi diretta o indiretta.
In alternativa, il cambiamento chimico può produrre una distorsione fisica nel DNA che blocca la replicazione e / o la trascrizione, causando la morte cellulare. Pertanto, le lesioni del DNA possono essere mutagene e / o letali. Alcune lesioni sono spontanee e si verificano a causa della reattività chimica intrinseca del DNA e della presenza di specie chimiche normali e reattive all'interno della cellula.
Ad esempio, la citosina di base subisce la deaminazione idrolitica spontanea per dare uracile. Se lasciato non riparato, l'uracile risultante formerebbe una coppia di basi con adenina durante la successiva replicazione, dando origine a una mutazione puntiforme. La depurazione è un'altra reazione idrolitica spontanea che coinvolge la scissione del legame N-glicosilico tra N-9 delle basi puriniche A e G e C-l 'dello zucchero desossiribosio e quindi la perdita di basi puriniche dal DNA. La spina dorsale zucchero-fosfato del DNA rimane intatta. Il sito apurinico risultante è una lesione non codificante, poiché le informazioni codificate nelle basi purine vengono perse.
2. Danno ossidativo:
Ciò avviene in condizioni normali a causa della presenza di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in tutte le cellule aerobiche, ad esempio il superossido, il perossido di idrogeno e, soprattutto, il radicale idrossilico (OH). Questo radicale può attaccare il DNA, in un certo numero di punti, producendo una gamma di prodotti di ossidazione con proprietà II alterate, per esempio 8-oxoguanine, 2-oxoadenine e 5-formyluracil. I livelli di questi possono essere aumentati dai radicali idrossili dalla radiolisi dell'acqua provocata dalle radiazioni ionizzanti.
3. Alchilazione:
Gli agenti alchilanti sono sostanze chimiche elettrofile che aggiungono prontamente gruppi alchilici (ad es. Metil) a varie posizioni su acidi nucleici distinti da quelli metilati dai normali enzimi metilanti. Esempi comuni sono metilmetano solfonato (MMS) ed etilnitrosourea (ENU).
Esempi tipici di basi metilate sono 7-metilguanina, 3-metil-adenina, 3- metilguanina e 0 6 -metilguanina. Alcune di queste lesioni sono potenzialmente letali in quanto possono interferire con lo svolgimento del DNA durante la replicazione e la trascrizione. Molti sono anche indirettamente mutageni; tuttavia, la 0, 6 -metilguanina è una lesione direttamente mutagenica in quanto può basarsi sull'associazione con timina durante la replicazione.
4. Addotti ingombranti:
I dimeri di ciclobutano pirimidina sono formati mediante luce ultravioletta da pirimidine adiacenti su un trefolo mediante ciclizzazione degli atomi di carbonio C5 e C6 a doppio legame di ciascuna base per fornire un anello di ciclobutano. La risultante perdita di accoppiamento della base con il filo opposto provoca una denaturazione localizzata del DNA che produce una lesione voluminosa che potrebbe interrompere la replicazione e la trascrizione. Un altro tipo di dimero pirimidinico, il 6, 4-fotoprodotto, risulta dalla formazione di un legame tra C6 di una base pirimidina e C4 della base adiacente.
Quando il benzene cancerogeno di catrame di carbone [a] pirene viene metabolizzato dal citocromo P-450 nel fegato, uno dei suoi metaboliti (un epossido di diolo) può legarsi covalentemente al gruppo 2-ammino di residui di guanina. Molti altri agenti aromatici arilanti formano addotti covalenti con DNA. Il fegato cancerogeno aflatossina B, si lega anche covalentemente al DNA.
Riparazione del DNA:
I sistemi di riparazione riconoscono una varietà di cambiamenti nel DNA per iniziare l'azione. Una cellula può avere diversi sistemi per affrontare il danno al DNA. Questi sistemi includono quanto segue: (1) Riparazione diretta, (2) Riparazione escissione (3) Riparazione non corrispondente, (4) Sistemi tolleranti e (5) Sistemi di recupero.
1. Riparazione diretta:
L'inversione o semplice rimozione del danno al DNA è nota come riparazione diretta, ad esempio rimozione dei legami covalenti tra i due 4 e due 5 atomi di carbonio dei due residui di timina che partecipano alla formazione dei dimeri di timina.
I dimeri di timina sono generalmente formati a causa dell'irradiazione UV e interferiscono con la replicazione e la trascrizione. Kelner (1949) osservò che un gran numero di batteri poteva sopravvivere a grandi dosi di radiazioni UV; se fossero stati esposti a un'intensa fonte di luce visibile.
Questo fenomeno si chiama photoreactivation. È stato successivamente dimostrato che durante l'irradiazione UV un particolare enzima è legato selettivamente al DNA batterico. Durante il processo di fotoreattivazione, l'enzima viene attivato dalla luce visibile. Fende i dimeri di timina, ripristinandoli così nella loro forma originale. Questo processo di riparazione è enzimatico e dipendente dalla luce.
2. Riparazione dell'escissione:
In questo meccanismo di riparazione, il segmento danneggiato o alterato del filamento di DNA viene rimosso e al suo posto viene sintetizzata una nuova porzione di DNA. Anche se i sistemi di riparazione per escissione variano nella loro specificità, il percorso principale prevede i seguenti tre passaggi:
(i) Riconoscimento e incisione:
La sezione danneggiata / alterata di un filamento di DNA è riconosciuta da un'endonucleasi; questo enzima taglia quindi la parte interessata su entrambi i lati del danno.
(ii) Escissione:
Un'esonucleasi 5 '-> 3' (DNA polimerasi I) digerisce la sezione danneggiata / alterata; questo genera una regione a filamento singolo nella doppia elica del DNA.
(iii) Sintesi:
In questa fase, la regione a singolo filamento prodotta dall'escissione funge da modello per una DNA polimerasi che sintetizza la sostituzione per il segmento asportato. La ligasi del DNA quindi sigilla il nick che rimane dopo la sintesi della sostituzione per la sezione asportata.
In E. coli, l'escissione è molto probabilmente dovuta all'attività di esonucleasi 3 '-> 5' della DNA polimerasi I, mentre la sintesi è realizzata dall'attività polimerasi 5 '-> 3' dello stesso enzima. I sistemi di riparazione di escissione sono abbastanza comuni sia nei procarioti che negli eucarioti. Alcuni di questi sistemi riconoscono un danno generale al DNA, mentre altri sono molto specifici, ad esempio le endonucleasi AP rimuovono i residui di ribosio dai siti di depurazione. La riparazione dell'escissione coinvolge diverse lunghezze di DNA ed è raggruppata nelle seguenti tre classi:
(a) Riparazione di patch molto brevi (VSP):
Questo sistema si occupa della riparazione di disallineamenti tra basi specifiche.
(b) riparazione rapida delle patch:
In questo sistema circa 20 basi escono lungo il filamento di DNA e i danni vengono riparati attraverso i geni uvr (uvr, A, B, C, di E.coli), codificando per componenti di un'endonucleasi di riparazione. Un altro enzima uvr D è necessario anche per l'attività elicasi.
(c) riparazione patch lunga:
Questo sistema comporta l'escissione di circa 1500 segmenti lunghi di basi, ma a volte il segmento asportato può essere> 9000 basi. È molto meno comune e deve essere indotto da un danno che blocca la replicazione. In E. coli questo sistema coinvolge anche i geni uvr e la DNA polimerasi I.
3. Riparazione non corrispondente:
Comporta la correzione di disallineamenti o accoppiamenti tra basi che non sono complementari. I disallineamenti possono sorgere sia (a) durante la replicazione o (b) a causa di alterazioni di base (ad esempio, deaminazione della citosina in uracile) e risultati in distorsioni strutturali nella doppia elica del DNA. Queste alternanze sono gestite in E. coli dal sistema di riparazione per escissione molto breve che viene descritto di seguito.
Sistema di riparazione non compatibile in E. coli:
Quando c'è una discrepanza in una coppia di basi come in GC -> GT, in teoria può essere riparata per dare origine a un tipo selvaggio (GC) oa un tipo mutante (AT). Pertanto, il sistema di riparazione deve distinguere tra vecchi e nuovi filamenti e riparare solo il nuovo filamento per ripristinare il tipo selvaggio.
Questo viene fatto da un sistema di riparazione di escissione a patch molto breve e richiede quattro proteine cioè Mut L, Mut S, Mut U e Mut H codificate in E. coli rispettivamente dai geni mut L, mut S, mut U e mut H. Errori di mismatch prodotti durante la replicazione sono corretti dal sistema di riparazione delle dighe.
La madre del gene di E. coli produce una metilasi che metilato l'adenina della sequenza GATC su entrambi i filamenti di DNA. La replicazione di una sequenza GATC completamente metilata produce una sequenza emimetilata in cui i residui di A nei fili recentemente sintetizzati non sono metilati.
Lo stato non metilato di questa sequenza bersaglio viene utilizzato per identificare il nuovo filamento; le basi attorno al sito di mismatch nel nuovo filamento vengono asportate e viene sintetizzata una sostituzione. Il sistema coinvolge i prodotti dei geni mut L, mut S, mut H e uvr D.
Riparazioni di sistemi di recupero:
Questi sistemi sono anche noti come "riparazione post-replica" o "riparazione per ricombinazione". In E.coli, questo sistema di riparazione è basato sul gene rec A che produce la proteina Rec A. Rec Una proteina funziona nello scambio di filamenti tra le molecole di DNA durante la ricombinazione genetica e funziona anche nello scambio a singolo filamento durante la riparazione della ricombinazione. Sembra che ci siano due percorsi rec, uno che coinvolge i geni rec B, C e l'altro che interessa rec F.
Questo sistema di riparazione funziona quando una distorsione strutturale blocca la replicazione nel sito danneggiato. Ad esempio, i mutanti di E. coli carenti nella riparazione di escissione non saranno in grado di rimuovere i dimeri di timina. In tale situazione, la replica procede normalmente fino ai siti danneggiati; la DNA polimerasi blocca la replicazione del filamento interessato e reinizia la replicazione saltando oltre il sito danneggiato.
Il filo complementare viene replicato normalmente nel sito danneggiato nell'altro filo. Pertanto la replicazione produce una progenie normale della molecola di DNA e una molecola che ha il dimero di timina in un unico filamento e una lunga lacuna nel suo filamento complementare. La molecola di DNA progenie con dimero di timina andrebbe persa a meno che non venga riparata riempiendo il vuoto in uno dei suoi filamenti.
Ciò è ottenuto mediante uno scambio a singolo filamento tra le due molecole di DNA della progenie; la regione dello scambio colma il vuoto ed è indotta dalla proteina Rec A. Come risultato di questo scambio, la normale molecola di progenie ha una regione a singolo filamento che ha un gap. Questa lacuna è riparata dalla sintesi del DNA.
Sistema di tolleranza:
Questi sistemi si occupano dei danni che bloccano la normale replica nel sito danneggiato, permettendo la replica dei siti danneggiati con un'alta frequenza di errori. Questi sistemi possono essere particolarmente importanti negli eucarioti dove la dimensione del genoma è molto grande e quindi una riparazione completa del danno è piuttosto improbabile.
