In assegno Prova a scoprire la capacità di un batterio di idrolizzare il triptofano amminoacidico (con figura)

In prova per scoprire la capacità di un batterio di idrolizzare il triptofano degli amminoacidi!

Principio:

Alcuni batteri hanno la capacità di idrolizzare l'aminoacido triptofano in indolo, in quanto possono produrre l'enzima 'triptofanoza'.

Il triptofano viene idrolizzato con la produzione di indolo, acido piruvico e ammoniaca. L'indolo viene rilevato dal reagente colorato, la paradimetilaminobenzaldeide (p-DMAB, ovvero il reagente di Kovac), che produce un anello rosa. L'indolo reagisce con p-DMAB per produrre il composto "composto rosso-violetto quinoidale (colorante rosindolo)", di colore rosa. L'anello viene prodotto in superficie, quando il reagente viene preparato in alcool amilico.

Nel test dell'indolo, i batteri test vengono coltivati in un mezzo di brodo contenente triptofano. Se i batteri hanno la capacità di idrolizzare il triptofano in indolo, un anello rosa si forma sulla superficie della coltura di brodo con l'aggiunta di p-DMAB.

Materiali richiesti:

Provette, matraccio conico, tappi di cotone, ansa da inoculo, autoclave, becco Bunsen, camera a flusso laminare, vasetto di raccolta, incubatore, brodo triptone, reagente di Kovac (paradimetilaminobenzaldeide), colonie isolate o colture pure di batteri.

Procedura:

1. Gli ingredienti del brodo triptone o la sua polvere pronta per il fabbisogno di 100 ml del brodo vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml agitandoli e agitandoli. Il triptone funge da fonte di triptofano. Pertanto, l'aggiunta di triptofano al brodo è facoltativa (Figura 7.3).

2. Il suo pH viene determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 5 usando HC1 0, 1 N se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore. Il pallone viene riscaldato, se necessario, per sciogliere completamente gli ingredienti.

3. Il brodo viene distribuito in cinque provette (circa 5 ml ciascuna), con tappo di cotone, coperte con carta artigianale e legate con filo o elastico.

4. I tubi di brodo sono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

5. I tubi di brodo sono lasciati raffreddare a temperatura ambiente.

6. I batteri test vengono inoculati in modo asettico, preferibilmente in una camera a flusso laminare, nel brodo con l'aiuto di un ciclo di inoculo sterilizzato su fiamma bunsen. Il ciclo è sterilizzato dopo ogni inoculazione.

7. Le provette di brodo inoculato vengono incubate a 37 ° C per 48 ore in un incubatore.

8. Il reagente colorato, para-dimetilaminobenzaldeide (p-DMAB), (cioè il reagente di Kovac) viene fatto cadere nelle provette di brodo (0, 5 ml ciascuna) e osservato dopo 1 minuto.

In alternativa:

7. Le strisce di carta imbevute di acido ossalico vengono poste alla bocca dei tubi di brodo inoculato, in modo che circa la metà delle strisce di carta rimangano all'interno dei tubi senza toccare il brodo e l'altra metà rimanga all'esterno. Per questo, la carta da filtro viene tagliata in strisce di circa 35 mm di lunghezza e 5 mm di larghezza. Le strisce vengono immerse in soluzione acquosa satura calda di acido ossalico e asciugate prima dell'uso.

8. Le provette di brodo inoculato vengono incubate a 37 ° C per 48 ore in un incubatore.