Esperimento per coltivare ed enumerare un batteriofago
Sperimenta per coltivare ed enumerare un batteriofago!
Principio:
Una sospensione di batteri, sensibili a un batteriofago (virus che infetta i batteri) viene seminata con tale batteriofago e lasciata crescere come prato confluente su una piastra di agar.
Le particelle di batteriofago crescono all'interno delle cellule dei batteri e le lisano. La lisi delle cellule dei batteri provoca la formazione di zone chiare nel prato confluente dei batteri. Queste zone chiare sono chiamate "placche". Si presume che ogni zona chiara sia formata da una singola particella di batteriofago. Pertanto, il numero di unità di formazione della placca (PFU) rappresenta il numero del batteriofago.
La tecnica di diluizione seriale viene utilizzata nella conta dei batteriofagi simile a quella utilizzata nella conta dei batteri. Il numero di particelle di fago contenute in un campione viene determinato contando il numero di placche formate sulla piastra di agar con semi e moltiplicando questo per il fattore di diluizione.
Per determinare un conteggio fagico valido, il numero di placche per piastra non deve superare 300 né essere inferiore a 30. Le piastre che mostrano più di 300 PFU sono definite "troppo numerose per contare" (TNTC), mentre le piastre con meno di 30 PFU sono definite 'troppo pochi per contare' (TFTC).
Materiali richiesti:
Brodo di triptone, triptone di agar morbido, tryptone hard agar, matraccio conico, provette, capsule di Petri sterilizzate, tamponi di cotone, coltura di batteriofagi (Es .: colifagina T 2 ), coltura di brodi nutrienti dei batteri (Es: Escherichia coli B), pipette sterilizzate, autoclave, bagno di acqua calda, bruciatore Bunsen, camera a flusso laminare, vasetto di raccolta, incubatore.
Procedura:
1. Quindici pipette (in un contenitore per pipette in acciaio inossidabile) e cinque capsule di Petri vengono sterilizzate in un forno ad aria calda a 180 ° C per 3 ore. In alternativa, possono essere coperti con carta artigianale, legati con filo o elastico e sterilizzati in un'autoclave insieme al supporto (Figura 8.3).
2. Gli ingredienti del brodo triptone o della sua polvere pronta per l'uso, necessari per 100 ml del brodo, vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml agitandoli e agitandoli. Il suo pH è regolato a 7, 5 usando 0, 1 N HCI o 0, 1 N NaOH come richiesto. Il pallone viene riscaldato, se necessario, per sciogliere completamente gli ingredienti.
3. Il brodo viene distribuito in 10 provette (da 9 ml ciascuna), con tappo di cotone, coperte con carta artigianale e legate con filo o elastico.
4. Gli ingredienti del terreno triptone di agar morbido o della sua polvere pronta per l'uso, necessari per 100 ml del mezzo, vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml agitandoli e agitandoli. Il suo pH è regolato a 7, 5 usando 0, 1 N HCI o 0, 1 N NaOH come richiesto. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno.
5. Questo mezzo liquido viene distribuito in 5 provette (2 ml ciascuna), tappate in cotone, coperte con carta artigianale e legate con filo o nastro di gomma.
6. Gli ingredienti del terreno triptone di agar duro o della sua polvere pronta per il fabbisogno di 100 ml del mezzo vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml mediante riscaldamento dopo aggiustamento del pH a 7, 5. La fiaschetta è in cotone, coperta con carta artigianale e legata con filo o elastico.
7. I 10 tubi di brodo di triptone, i 5 tubi di agar morbido di triptone e il matraccio contenente terreno di agar duro di triptone vengono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.
8. Il terreno sterilizzato a triptone duro di agar nel matraccio conico viene versato in 5 piastre di Petri sterilizzate in modo asettico per ottenere 5 piastre di tryptone duro.
9. Un ml della coltura madre del batteriofago (es: colifagina T 2 ) viene trasferito asetticamente, preferibilmente in una camera a flusso laminare, in un tubo di brodo triptone (9 ml) utilizzando una pipetta sterilizzata. Questo diventa la diluizione 10 volte (cioè 10 -1 ). Questo viene diluito asetticamente in serie negli altri nove tubi di brodo, in modo da ottenere una diluizione finale di 10 -10 (Figura 8.4).
10. I 5 tubi di agar morbido triptone sterilizzati vengono prelevati e riscaldati a bagnomaria a 100 ° C, in modo da sciogliere l'agar. Le provette vengono raffreddate e i tubi morbidi morbidi fusi vengono mantenuti a 45 ° C.
11. Tra le 10 provette precedenti contenenti fagi a diverse concentrazioni, vengono selezionate cinque provette (ovvero 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 e 10 -9 ). Da questi tubi, 1 ml asetticamente ciascuno viene trasferito alle cinque provette di agar morbido tryptone utilizzando pipette sterilizzate separate.
12. Due gocce di coltura di brodi nutrienti dei batteri (Es: Escherichia coli B) sono trasferite in modo asettico, preferibilmente in una camera a flusso laminare, a ciascuna provetta di triptone di agar morbido contenente il batteriofago in cinque diverse concentrazioni (da 10 a 5-10 ).
13. Il contenuto dei cinque tubi di agar morbido triptone contenenti il batteriofago e i batteri vengono rapidamente miscelati ruotando tra i palmi delle mani.
14. Il contenuto viene versato in modo asettico sulle cinque piastre di tryptone duro contrassegnate da 10 -5 a 10 -9, formando così una preparazione di coltura a piastra a doppio strato. Le piastre sono roteate delicatamente e lasciate indurire.
15. Le piastre vengono incubate in posizione capovolta a 37 ° C in un incubatore.
osservazioni:
1. Tutte le piastre sono osservate per le unità formanti placca (PFU) che si sviluppano come zone chiare sul prato dei batteri.
2. Solo le piastre con PFU tra 30 e 300 sono considerate per l'enumerazione del fago. Viene contato il numero di PFU su ciascuna piastra. I piatti che presentano più di 300 PFU sono designati "troppo numerosi per contare" (TNTC), mentre i piatti che mostrano meno di 30 PFU sono indicati come "troppo pochi per contare" (TFTC). Tali piatti non sono considerati.
3. Sulla base delle osservazioni, il numero di batteriofagi per ml della coltura fagica è calcolato utilizzando la seguente formula.
Numero di fagi / ml = numero di fattori di diluizione X PFU
Ad esempio, se il numero di PFU è 280 in una diluizione di 10 -7, allora il numero di fago nella coltura del fago è 280 x 10 7 fago / ml (= 2, 80 x 10 9 fago / ml).
