Esperimento per isolare il colifago di un virus (con diagramma)

Sperimenta per isolare la colifagia di un virus!

Principio:

Il batteriofago o fago (virus) che infetta i batteri, Escherichia coli è chiamato colifago (coli: E. coli-, fago: batteriofago).

Può essere ottenuto da una varietà di fonti naturali, come suolo, materiale fecale e liquami grezzi. Il suo isolamento da queste fonti non è molto facile, in quanto è presente in bassa concentrazione.

Pertanto, in primo luogo il suo numero è aumentato da una fase di arricchimento, in cui una ricca coltura dei batteri ospiti (cioè E. coli) viene aggiunta al campione contenente colifago e incubata. La colifagina infetta E. coli e aumenta di numero in modo abbondante. Questa coltura ricca di colifagi viene centrifugata per stabilizzare il particolato.

Il sedimento viene scartato e il supernatante viene filtrato attraverso un filtro microbico per trattenere i batteri e le altre particelle, consentendo al tempo stesso il passaggio della colifagina. Il filtrato, ricco di colifagi, è utilizzato per seminare una sospensione di E. coli, che è poi permesso di crescere come prato confluente su una piastra di agar.

La colifagia cresce all'interno delle cellule di E. coli e le lessa. La lisi delle cellule dei batteri provoca la formazione di zone chiare sul prato confluente dei batteri. Queste zone chiare sono chiamate placche. Si presume che ogni zona chiara sia formata da un singolo colofago.

Materiali richiesti:

Pipette, matracci conici, capsule di Petri, provette, tappi di cotone, becco Bunsen, vasetto di raccolta, centrifuga, apparato di filtrazione a membrana, camera a flusso laminare, autoclave, incubatore, brodo di batteriofagi, agar morbido triptone, tryptone hard agar, coltura di brodi nutrienti del batteri Escherichia coli (es. E. coli B), campione (ad es., liquame crudo).

Procedura:

1. Cinque pipette (in un contenitore per pipette in acciaio inossidabile) e cinque piastre di Petri vengono sterilizzate in un forno ad aria calda a 180 ° C per 3 ore. In alternativa, possono essere coperti con carta artigianale, legati con filo o elastico e sterilizzati in un'autoclave insieme al supporto (Figura 8.5).

2. Gli ingredienti del terreno di brodo di batteriofagi o della sua polvere pronta per l'uso, necessari per 100 ml del mezzo, vengono pesati, sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml e pH regolato a 7.6. La fiaschetta è in cotone, coperta con carta artigianale e legata con filo o elastico.

3. Gli ingredienti del terreno triptone di agar morbido o della sua polvere pronta per l'uso, necessari per 100 ml del mezzo, vengono pesati, sciolti in 100 ml di acqua distillata in un matraccio conico da 250 ml e pH regolato a 7, 5.

4. Questo mezzo liquido viene distribuito in 5 provette (2 ml ciascuna), con tappo di cotone, coperto con carta artigianale e legato con filo o nastro di gomma.

5. Gli ingredienti del tryptone hard agar medium o della sua polvere pronta per il fabbisogno per 100 ml del mezzo vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml mediante riscaldamento dopo aggiustamento del pH a 7.5. La fiaschetta è in cotone, coperta con carta artigianale e legata con filo o elastico.

6. Il matraccio contenente brodo di batteriofago, i 5 tubi di agar morbido al triptone, il matraccio contenente terreno duro di agar tryptone e una beuta vuota da 250 ml di cotone sono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

7. Il terreno sterilizzato a triptone duro di agar nel matraccio conico viene versato in modo asettico nelle 5 capsule di Petri sterilizzate e lasciato raffreddare, in modo da ottenere 5 piastre di tryptone duro.

8. Nel matraccio vuoto da 250 ml sterilizzato imbevuto di cotone, 5 ml di brodo di batteriofagi sterilizzati, 5 ml di coltura di brodo E. coli B e 45 ml di liquami grezzi vengono trasferiti in modo asettico, preferibilmente in una camera a flusso laminare (Figura 8.6) .

9. Il matraccio viene incubato a 37 ° C per 24 ore, in modo da consentire alla colifagia delle acque reflue di proliferare all'interno delle cellule batteriche ospiti (cellule di E. coli B).

10. Il contenuto del pallone viene versato in provette da centrifuga da 100 ml e centrifugato a 2500 rpm per 20 minuti in una centrifuga per depositare le particelle. Il sedimento viene scartato.

11. Il supernatante, ricco di colifagi, viene filtrato attraverso un apparato di filtrazione a membrana. Il residuo viene scartato.

12. I cinque tubi di agar morbido triptone sterilizzati vengono prelevati e riscaldati a bagnomaria a 100 ° C, in modo da sciogliere l'agar. Le provette vengono raffreddate e mantenute a 45 ° C su un bagnomaria.

13. Usando una pipetta sterile, 1, 2, 3, 4 e 5 gocce di filtrato privo di batteri, ricco di colifagi viene trasferito in modo asettico ai cinque tubi di agar morbido triptone.

14. Per ogni tubo di agar morbido triptone, 0, 1 ml di una coltura di brodo nutriente di Escherichia coli B vengono trasferiti in modo asettico.

15. Il contenuto dei cinque tubi di agar morbido tryptone aventi il ​​virus, la colifagina e i batteri, E. coli B vengono rapidamente miscelati ruotando le provette tra i palmi delle mani.

16. Il contenuto viene versato sulle cinque piastre di tryptone duro (etichettate da 1 a 5 gocce), formando così una preparazione per la coltura della piastra a doppio strato. Le piastre sono roteate delicatamente e lasciate indurire.

17. Le piastre inoculate vengono incubate in posizione capovolta a 37 ° C per 24 ore in un incubatore.

osservazioni:

1. Tutte le piastre sono osservate per le unità formanti placca (PFU) che si sviluppano come zone chiare sul prato dei batteri. La formazione della placca è indicativa della presenza di colifagi nella coltura.

2. Ogni placca rappresenta una ricca crescita di colifago isolato.

3. Il numero di placche viene conteggiato in tutte le piastre e tabulato come segue (Tabella 8.1).

Tabella 8.1: Osservazioni sul numero di colifagi :

Numero di gocce

Numero di targhe

1 goccia

2 gocce

3 gocce

4 gocce

5 gocce