Tecniche di analisi immunoistochimica per la rilevazione di antigeni tumorali
I saggi immunoistochimici sono ampiamente utilizzati per rilevare antigeni tumorali e classificare i tipi di cellule linfocitarie in sezioni di patologia chirurgica.
Il campione di tessuto è fissato su un vetrino.
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L'enzima marcato con mAb (coniugato) viene stratificato sul campione e incubato.
io. Se il campione ha un antigene specifico contro l'mAb, il coniugato si lega all'antigene sul campione.
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Dopo il lavaggio, il substrato viene aggiunto e incubato.
io. Lo sviluppo del colore denota che l'antigene specifico contro il mAb è presente nella sezione tissutale.
ii. In assenza di antigene specifico, non c'è sviluppo di colore.
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Il vetrino viene lavato e la sezione di tessuto è vista al microscopio per la presenza di colore.
La perossidasi di rafano (HRP) è l'enzima comunemente usato nelle tecniche immunoistochimiche. Il substrato per HRP è il perossido di idrogeno e la diammino-benzidina. La reazione di HRP con diaminobenzidina produce un colore nero.
La perossidasi-antiperoxidasi (PAP) è un altro metodo utilizzato nella patologia chirurgica per rilevare gli enzimi e gli antigeni tumorali.
È un metodo in tre fasi:
Passo 1:
Il tessuto sospettato di avere un antigene particolare è fissato su un vetrino.
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L'anticorpo di coniglio noto all'antigene in questione viene lasciato cadere sul tessuto (sospettato di avere l'antigene) fissato su un vetrino.
io. Se l'antigene corrispondente si trova nel tessuto, l'anticorpo si lega ad esso. Il vetrino viene lavato dopo l'incubazione.
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Passo 2:
L'immunoglobulina anti-coniglio (chiamata anticorpo di collegamento) viene lasciata cadere sul vetrino.
io. Se il primo anticorpo di coniglio si trova nel vetrino (legato all'antigene) l'immunoglobulina anti-coniglio si lega all'anticorpo di coniglio. Dopo l'incubazione il vetrino viene lavato.
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Passi 3:
Un complesso immunitario, costituito da anticorpi di coniglio per perossidasi, combinato con perossidasi, viene lasciato cadere. Questo anticorpo di coniglio si lega all'immunoglobina anti-coniglio (link antibody-step 2) attraverso la sua regione Fc. Dopo l'incubazione il vetrino viene lavato.
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Infine, viene aggiunto il substrato di perossidasi. Il substrato reagirà con la perossidasi provocando la formazione di un prodotto colorato che si vede al microscopio.
io. La presenza del prodotto colorato sul tessuto indica la presenza dell'antigene corrispondente.
ii. L'assenza del prodotto colorato sulla diapositiva indica che l'antigene in questione è assente nel tessuto.
