Test di orto-nitrofenil galattoside sui batteri per trovare la loro capacità di idrolizzare l'orto-nitrofenil-PD-galattoside

Leggi questo articolo per conoscere le prestazioni del test orto-nitrofenil galattoside sui batteri per trovare la loro capacità di idrolizzare l'orto-nitrofenil-PD-galattoside!

Principio:

Alcuni batteri hanno la capacità di fermentare il lattosio. Sono chiamati "batteri fermentanti il ​​lattosio" o "lattanti-fomentanti".

Gli altri, che non possono fermentare il lattosio, sono chiamati batteri lattosio-non-fermentanti o "lattosio-non-fomentanti".

I batteri che fermentano il lattosio possono produrre due enzimi, ossia "permeasi" e "β-galattosidasi", che sono coinvolti nella fermentazione del lattosio. La permeasi aiuta nell'ingresso del lattosio nelle cellule batteriche, mentre la β-galattosidasi idrolizza il lattosio in glucosio e galattosio, la β-galattosidasi è un enzima inducibile intracellulare, la cui produzione è indotta dalla presenza di lattosio nell'ambiente delle cellule batteriche.

Mentre i batteri fermentanti il ​​lattosio possono produrre sia la permeasi che la β-galattosidasi, i batteri lattosio-non fermentanti non possono produrre la permeasi, ma possono o meno produrre β-galattosidasi. Il test ONPG viene eseguito per scoprire la capacità dei batteri lattosio-non fermentanti di produrre β-galattosidasi.

Per questo, la membrana cellulare delle cellule di batteri lattosio-non fermentanti viene sciolta aggiungendo toluene, in modo da liberare tutti gli enzimi intracellulari inclusa la P-galattosidasi, se presente. L'enzima, β-galattosidasi, idrolizza il substrato ortho- nitrophenyl-β-D-galtoside (ONPG) in orto-nitrofenolo, che è di colore giallo.

Nel test orto-nitrofenil galattoside (test ONPG), i batteri test vengono coltivati ​​su slant triplo zucchero ferro agar (TSI agar), che contengono lattosio. Se i batteri sono un lattosio-non-fermentato, come indicato dal culo rosso e dal taglio obliquo, una sospensione densa dei batteri viene fatta in soluzione salina, a cui si aggiunge il toluene seguito dalla soluzione ONPG. Se i batteri hanno la capacità di produrre l'enzima P-galattosidasi, il colore della sospensione dei batteri diventa giallo.

Materiali richiesti:

Provette, matraccio conico, tappi di cotone, ansa da inoculo, ago da inoculo, autoclave, becco Bunsen, camera a flusso laminare, vasetto di raccolta, incubatore, agar TSI, toluene, soluzione di o-nitrofenil-β-D-galattoside (ONPG), colonie isolate o pure culture di batteri.

Procedura:

1. Gli ingredienti del mezzo di agar STATO (contenente i 3 zuccheri e il ferro come componenti principali) o la sua polvere pronta per il fabbisogno di 100 ml del mezzo vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml mediante agitazione e vortice (Figura 7.16).

2. Il suo pH viene determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 4 usando HCl 0, 1 N se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore.

3. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno.

4. Prima che si solidifichi, il terreno in condizioni di fusione fusa viene distribuito in 5 provette (circa 20 ml ciascuna).

5. Le provette sono tappate in cotone, coperte con carta artigianale e legate con filo o elastico.

6. Sono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

7. Dopo la sterilizzazione, vengono rimossi dall'autoclave e mantenuti in una posizione inclinata per raffreddare e solidificare il terreno, in modo da ottenere slant in agar TSI.

8. I batteri da testare vengono inoculati in modo asettico, preferibilmente in una camera a flusso laminare, negli slant, penetrando nel calcio e strisciando sulla superficie degli slant con l'aiuto di un ago sterilizzato a fiamma. L'ago viene sterilizzato dopo ogni inoculazione.

9. Gli slant inoculati vengono incubati a 37 ° C per 24 ore in un incubatore.

10. Se il batterio è un fermentatore di lattosio, non è selezionato per il test ONPG. Se il batterio è lattosio-non-fermentatore, come indicato dal calcio rosso e dall'inclinazione rossa, è selezionato per il test ONPG.

11. In una provetta contenente 0, 25 ml di soluzione salina, viene posta una coltura spessa dei batteri mediante un'ansa ignifuga, in modo da formare una sospensione spessa dei batteri.

12. Una goccia di toluene viene aggiunta, mescolata e incubata per 5 minuti a 37 ° C.

13. La soluzione di O-nitrofenil galattoside (soluzione ONPG) viene aggiunta e incubata a 37 ° C per 30 minuti. Quindi si osserva il cambiamento di colore. Di nuovo il cambiamento di colore è osservato dopo 24 ore.

osservazioni:

1. Colore giallo prodotto: positivo ONPG.

2. Rimane incolore: ONPG negativo.