Test ossidasi sui batteri per scoprire la loro capacità di idrolizzare la gelatina producendo gelatinasi

Test ossidasi sui batteri per scoprire la loro capacità di idrolizzare la gelatina producendo gelatinasi!

Principio:

Alcuni batteri hanno la capacità di idrolizzare la gelatina, poiché possono produrre l'enzima proteolitico "gelatinasi".

Mentre la gelatina viene precipitata dal cloruro mercurico producendo traslucenza, i suoi prodotti finali idrolizzati non vengono precipitati dal cloruro mercurico, per il quale non producono tale traslucenza, piuttosto producono trasparenza.

Nel test di gelatinizzazione, i batteri test vengono fatti crescere su piastre di agar contenenti gelatina. Dopo che le colonie dei batteri sono visibili, le piastre sono allagate con una soluzione di cloruro mercurico. Se i batteri hanno la capacità di idrolizzare la gelatina, le sue colonie idrolizzano la gelatina nel terreno nelle aree circostanti, mentre il resto delle aree conserva la gelatina non idrolizzata.

Di conseguenza, allagando una soluzione di cloruro mercurico, intorno alle colonie si formano zone trasparenti trasparenti, poiché i prodotti idrolizzati formati attorno a loro non formano precipitati con il cloruro mercurico. D'altra parte, il resto delle aree delle piastre diventa traslucido, poiché la gelatina non idrolizzata in queste aree forma precipitati con cloruro mercurico.

Materiali richiesti:

Piastre di Petri, matraccio conico, tappi di cotone, ansa da inoculo, autoclave, becco Bunsen, camera a flusso laminare, vasetto di raccolta, incubatore, agar gelatinizzante di Fraizer, soluzione di cloruro mercurico, colonie isolate o colture pure di batteri.

Procedura:

1. Due piatti di Petri vengono puliti, coperti con carta artigianale e legati con filo o elastico (Figura 7.20). Questo passaggio e la sterilizzazione delle piastre di Petri nella fase 6 sono omessi, se le piastre di Petri sterilizzate a forno sono utilizzate direttamente

2. Gli ingredienti del mezzo di gelatina di gelatina di Fraizer (contenente la gelatina come componente principale) o la sua polvere pronta per il fabbisogno di 100 ml del mezzo vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml agitando e roteando .

3. Il suo pH è determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 2 usando HCI 0, 1 N se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore.

4. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno.

5. Il matraccio è tappato in cotone, coperto con carta artigianale e legato con filo o elastico.

6. Le due capsule di Petri e il matraccio conico contenente il mezzo di gelatina di gelatina di Fraizer vengono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

7. Dopo la sterilizzazione, vengono rimossi dall'autoclave e lasciati raffreddare per qualche tempo senza consentire al terreno di solidificarsi. Il raffreddamento del mezzo impedisce la formazione di condensa e l'accumulo di gocce d'acqua all'interno delle piastre. Se il terreno è già stato preparato e solidificato durante lo stoccaggio, deve essere liquefatto riscaldando accuratamente finché non si scioglie completamente.

8. Per preparare le piastre di gelatina di agar, prima che l'agar di gelatina sterilizzato di Frazier si raffreddi e si solidifichi, in condizioni di fuso caldo, viene versato in modo asettico, preferibilmente all'interno di una camera a flusso laminare, nelle due piastre di Petri sterilizzate (circa 20 ml ciascuna), quindi che il mezzo fuso copre completamente il fondo delle piastre di Petri.

Quindi, le piastre sono coperte con i loro coperchi e lasciate raffreddare, in modo da solidificare il mezzo in esse. Il vapore acqueo che può condensare sulla superficie interna delle piastre e dei coperchi viene evaporato mantenendo le piastre e i coperchi invertiti in un incubatore a 37 ° C per circa 1 ora.

9. Ogni piatto è segnato sul lato inferiore in quattro quarti.

10. L'inoculazione spot dei batteri di prova viene eseguita in modo asettico, preferibilmente all'interno di una camera a flusso laminare, al centro di ogni quarto facendo uno spot (o piccolo striscio) dei batteri con l'aiuto di un'ansa ignifuga. Il ciclo è sterilizzato dopo ogni inoculazione.

11. Le piastre inoculate vengono incubate in posizione capovolta, dall'alto verso il basso, a 37 ° C per 24-48 ore in un incubatore fino a quando le colonie dei batteri sono visibili.

12. Le piastre sono allagate con una soluzione di cloruro mercurico (HgCl ₂ ).