Test ossidasi sui batteri per scoprire la loro capacità di ossidare il citocromo C ridotto

Leggi questo articolo per conoscere il test dell'ossidasi sui batteri per scoprire la loro capacità di ossidare il citocromo C ridotto:

Principio:

Alcuni batteri hanno la capacità di ossidare il "citocromo C ridotto" presente nelle loro cellule al "citocromo C ossidato", in quanto possono produrre l'enzima "citocromo ossidasi".

Il citocromo C ossidato produce colore viola (viola di Wurster) con la tintura N-tetrametil-para-fenilendiammina (cioè reagente ossidasi).

Nel test dell'ossidasi, le piastre di agar nutrienti contenenti le colonie dei batteri test sono inondate dalla soluzione del reagente ossidasi. Se i batteri hanno la capacità di produrre l'enzima citocromo ossidasi, il colore delle colonie sulle piastre cambia in viola. Se i batteri non hanno la capacità di produrre citocromo ossidasi, le colonie mantengono il colore rosa originale del reagente ossidasi.

Materiali richiesti:

Piastre di Petri, matraccio conico, tappi di cotone, cappio per inoculo in filo di platino, autoclave, becco Bunsen, camera a flusso laminare, vasetto di raccolta, incubatore, striscia di carta Whatman, reagente ossidasi (N-tetrametil-para-fenilendiammina) agar nutriente, colonie isolate o culture pure di batteri.

Procedura:

(a) Metodo piastra:

1. Due piatti di Petri vengono puliti, coperti con carta artigianale e legati con filo o elastico (Figura 7.19). Questi passaggi e la sterilizzazione delle piastre di Petri nella fase 6 sono omessi, se le piastre di Petri sterilizzate a forno sono utilizzate direttamente.

2. Gli ingredienti del terreno di agar nutritivo o della sua polvere pronta per il fabbisogno per 100 ml del mezzo vengono pesati e sciolti in 100 ml di acqua distillata in una beuta da 250 ml agitandoli e agitandoli.

3. Il suo pH è determinato usando una carta pH o un pH metro e regolato a 7, 0 usando HCI 0, 1 N se è maggiore o usando 0, 1 N NaOH se è inferiore.

4. Il pallone viene riscaldato per sciogliere completamente l'agar nel terreno.

5. Il matraccio è tappato in cotone, coperto con carta artigianale e legato con filo o elastico.

6. Le due capsule di Petri e il matraccio conico contenente terreno di agar nutriente vengono sterilizzati a 121 ° C (15 psi di pressione) per 15 minuti in un'autoclave.

7. Dopo la sterilizzazione, vengono rimossi dall'autoclave e lasciati raffreddare per un po 'di tempo, senza consentire al terreno di solidificarsi. Il raffreddamento del mezzo impedisce la formazione di condensa e l'accumulo di gocce d'acqua all'interno delle piastre. Se il terreno è già stato preparato e solidificato durante lo stoccaggio, deve essere liquefatto riscaldando accuratamente finché non si scioglie completamente.

8. Per preparare le piastre di agar nutrienti, prima che l'agar nutritivo sterilizzato si raffreddi e si solidifichi, in condizioni di fuso caldo, viene versato in modo asettico, preferibilmente all'interno di una camera a flusso laminare, nelle due piastre di Petri sterilizzate (circa 20 ml ciascuna), in modo che il mezzo fuso copre completamente il fondo delle piastre di Petri.

Quindi, le piastre sono coperte con i loro coperchi e lasciate raffreddare, in modo da solidificare il mezzo in esse. Il vapore acqueo che può condensare sulla superficie interna delle piastre e dei coperchi viene evaporato mantenendo le piastre e i coperchi in posizione capovolta in un incubatore a 37 ° C per circa 1 ora.

9. Ogni piatto è segnato sul lato inferiore in quattro quarti.

10. L'inoculazione spot dei batteri di prova viene eseguita in modo asettico, preferibilmente in una camera a flusso laminare, al centro di ciascun quarto facendo uno spot (o piccolo striscio) dei batteri con l'aiuto di un'ansa fiamma-sterilizzata. Il ciclo è sterilizzato dopo ogni inoculazione.

11. Le piastre inoculate vengono incubate in posizione capovolta, dall'alto in basso, a 37 ° C per 24 ore in un incubatore fino a quando sono visibili colonie dei batteri.

12. Le piastre sono inondate di reagente ossidasi.

(b) Metodo di carta:

1. Una striscia di carta da filtro Whatman, immersa in reagente ossidasi all'1%, viene essiccata e tenuta al buio.

2. Prima dell'uso, viene inumidito e un anello dei batteri di prova viene posto su di esso come un punto con l'aiuto di un'ansa di filo di platino. Il ciclo del nicromo può ossidare il reagente. Pertanto, deve essere utilizzato il ciclo del platino.

3. Il punto viene osservato dopo 10 secondi.