I recenti progressi nella diagnostica della malaria

Recenti progressi nella diagnostica della malaria - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Introduzione:

In India, la malaria è un grave problema di salute; ci sono state frequenti epidemie nel Rajasthan e negli Stati del Nord-Est. In incidenza del Rajasthan, il P. falciparum è in aumento. A Delhi P. vivax è la specie più comune, ma si incontra anche il P. falciparum. La malaria, un problema mondiale, uccide ogni anno tra 1, 5 e 2, 7 milioni di persone. In altre parole uccide una persona (spesso un bambino <5 anni) ogni 12 secondi. Inoltre, ogni anno 300-500 milioni di persone sono infettate dalla malattia.

Per il controllo della malattia, la diagnosi rapida e precisa è la più importante. La diagnosi di malaria viene spesso effettuata solo sulla base di sintomi clinici, sebbene la sua accuratezza sia al massimo del 50%. Sono ora disponibili nuove tecniche diagnostiche avanzate. Le indagini introdotte di recente basate sul saggio immunologico sono rapide (<10 min / test) e almeno altrettanto sensibili della microscopia tradizionale.

Microscopia ottica: strisci di sangue densi e sottili:

La procedura di laboratorio tradizionalmente accettata per la diagnosi della malaria è stata l'esame microscopico degli strisci di sangue colorati con Giemsa o Macchia di campo. Idealmente, il sangue dovrebbe essere ottenuto da una puntura del dito; tuttavia, il sangue ottenuto mediante venipuntura e anticoagulazione (EDTA o eparina) è accettabile se esaminato immediatamente. Dovrebbero essere fatte entrambe le sbavature spesse e sottili. Lo striscio denso, concentra i globuli rossi 20 - 30 volte su una piccola superficie, aumenta la sensibilità della tecnica ed è molto meglio degli strisci sottili. Lo striscio sottile tuttavia è più specifico.

È il gold standard accettato per la diagnosi, ma è laborioso, e l'interpretazione dei risultati richiede una notevole esperienza, in particolare con parassitemia bassa. Inoltre, i parassiti del P falciparum che sono spesso sequestrati lontano dal sangue periferico possono facilmente essere persi.

Quantificazione dei parassiti mediante esame degli strisci di sangue:

Esistono molti metodi per quantificare i parassiti della malaria in strisci spessi. I livelli di parassita possono anche essere quantificati esaminando un sottile striscio di sangue. Uno svantaggio principale degli strisci spessi è che spesso richiede un certo grado di competenza che potrebbe non essere disponibile.

Teoricamente, l'esaminatore dovrebbe contare i campi a macchie spesse contenenti 20 o più leucociti / hpf. In realtà, i campi contenenti 20 o più leucociti sono troppo spessi per contare, mentre i campi più facili da leggere sono quelli che contengono solo cinque o sei leucociti / hpf.

Prima della colorazione, l'esaminatore dovrebbe essere in grado di leggere la stampa attraverso uno striscio di sangue ben preparato e denso. L'esame di strisci sottili è solo un decimo sensibile come l'esame di strisci folti. Pertanto, anche se l'esame degli strisci di sangue è accettabile come universale, "gold standard", non esiste in realtà un unico metodo standard, utilizzato da tutti gli investigatori, per quantificare i parassiti contando i parassiti negli strisci fitti.

Inoltre, sotto il personale addestrato, la mancanza di microscopi limita l'utilità dello striscio di sangue in molte aree endemiche. Riconoscendo questi limiti, sono state sviluppate tecniche alternative per la diagnosi della malaria.

Microscopia a fluorescenza:

Tre tecniche fluorescenti promettono una diagnosi di malaria.

Questi sono:

(i) Il metodo quantitativo buffy-coat (OBC) disponibile come kit commerciale

(ii) Il processo Kawamoto Acridine Orange (AO) e

(iii) procedura Benzothiocarboxypurine (BCP).

Queste tre tecniche sono rapide e facili da eseguire; quando ci sono più di 100 parassiti / μL, dimostrano sensibilità e specificità equivalenti a quelle ottenute con lo spalmato denso.

Entrambi i metodi OBC e Kawamoto utilizzano Acridine Orange (AO) come il fluorocromo per colorare gli acidi nucleici dei parassiti della malaria in un campione. BCP è anche un fluorocromo, che macchia gli acidi nucleici. AO non è specifico e macchia gli acidi nucleici da tutti i tipi di cellule.

Di conseguenza, l'esaminatore deve imparare a distinguere i parassiti fluorescenti dalle altre cellule e dai detriti cellulari. La sensibilità della colorazione AO ​​con livelli di parassiti inferiori a 100 parassiti / μL è stata del 41, 7-93%.

La specificità della colorazione AP per P. vivax e P. falciparum è rispettivamente del 52% e 93%. Il metodo BCP ha una sensibilità e una specificità superiori al 90%. Limitazione importante dei metodi basati su AO e BCP è la loro incapacità di differenziare tra le specie di Plasmodium. AO è pericoloso e richiede requisiti speciali di smaltimento.

OBC e BCP sono tecnicamente più impegnativi di Kawamoto. I metodi Kawamoto e AO richiedono attrezzature e materiali speciali e sono più costosi. Il prezzo di un microscopio a fluorescenza potrebbe essere un fattore limitante per i laboratori interessati a utilizzare questi metodi.

Rilevazione di sequenze specifiche di acidi nucleici:

Può essere utile la rilevazione di sequenze di acido nucleico specifiche per i parassiti del Plasmodium. Nelle tecniche basate sulla PCR, la sequenza target amplificata viene rilevata da sonde interne o analizzata mediante elettroforesi su gel. Il principale vantaggio dell'utilizzo di una tecnica basata sulla PCR è la capacità di rilevare una parassitemia bassa. Le infezioni con parassiti vivi possono essere rilevate con una specificità del 100%.

Tuttavia, tali tecniche sono costose e richiedono molta manodopera, richiedono una vasta esperienza tecnica, comportano più passaggi e non possono essere utilizzate per distinguere tra organismi vitali e non vitali.

Gli inibitori della PCR naturalmente presenti nei campioni di sangue possono causare un numero significativo di risultati falsi-negativi. Sono stati anche registrati risultati falsi positivi, a causa della contaminazione da carryover.

Le tecniche basate sulla PCR sono state utilizzate per lo screening dei donatori in un'area in cui la malaria è endemica. La sensibilità e la specificità dei metodi basati sulla PCR, stimati usando l'esame degli strisci di sangue come "gold standard", sono ciascuno del 90% o più.

Inoltre, ulteriori progressi nella tecnologia PCR potrebbero presto consentire ai parassiti vitali di distinguersi da quelli non vitali. Attualmente l'utilità di tale tecnologia è limitata dalla necessità di attrezzature di laboratorio costose, specializzate, personale addestrato in tecnologie genetiche e strutture "clean room", e da un costo elevato di enzimi e primer utilizzati.

Rilevazione antigene:

I test di rilevazione di anticorpi per la malaria erano limitati nella sensibilità e nella loro capacità di distinguere le infezioni attive da quelle precedenti. I test di nuova generazione, antigene-acquisizione sono in grado di rilevare meno parassiti e di produrre risultati rapidi (10 -15 min). Sono kit disponibili in commercio, che includono tutti i reagenti necessari e non richiedono un addestramento o attrezzatura estesi.

Esistono due antigeni parassitari utilizzati nei nuovi test diagnostici rapidi, protein-2 ricchi di istidina (HRP-2), che è prodotto solo da P. falciparum e dall'antigene del lattato-deidrogenasi parassita (pLDH), prodotto da tutti e quattro specie di plasmodio che infetta l'uomo. Entrambi gli antigeni sono secreti nel sangue da tutti gli stadi asessuati del parassita; l'antigene pLDH è prodotto anche dai gametociti.

Gli ultimi test di cattura di antigeni sono rapidi e semplici da eseguire e hanno limiti di rilevazione paragonabili a quelli di microscopia di alta qualità (cioè 100-200 parassiti / μL). Quando ci sono più di 60-100 parassiti / μL, la HRP- I test basati su 2 sono altamente sensibili (> 90%) e (> 90%) specifici, se confrontati con la microscopia a striscio denso.

Attualmente sono disponibili in commercio due test di questo tipo, il test ParaSight F e il test Malaria Pf (immunocromatografico) TIC. Entrambi i test vengono eseguiti su campioni di puntura di dito e rilevano solo la malaria da P. falciparum.

Sono basati su anticorpi monoclonali a HRP-2, che sono immobilizzati su strisce di nitrocellulosa, per produrre strisce reattive o test di cartone (test ICT Pf). In ogni test, un risultato positivo è indicato dall'apparizione di una linea rossa sulla striscia reattiva, dove gli anticorpi monoclonali sono immobilizzati.

Entrambi i test contengono anche un controllo integrato; una linea di controllo deve apparire per un test da considerare valido. La sensibilità e la specificità del test ParaSight F sono rispettivamente dell'88% e del 97%, paragonabili alla PCR.

Sebbene i test sierologici basati su HRP-2 abbiano permesso una diagnosi rapida della malaria da falciparum, hanno un'utilità limitata. Poiché HRP-2 è presente solo in P. falciparum, i test basati sul rilevamento di HRP-2 sono negativi con l'infezione causata da vivax, ovale o malaria.

Pertanto, molti casi di malaria non falciparum verranno erroneamente diagnosticati come negativi alla malaria. Un'altra limitazione dei test basati su HRP-2 è che l'HRP-2 persiste nel sangue molto tempo dopo che i sintomi clinici sono scomparsi e che i parassiti apparentemente si sono liberati dall'ospite.

Infatti, HRP-2 è stato scoperto nelle mummie. I test per questo antigene potrebbero quindi non essere utili per lo screening delle popolazioni indigene in aree endemiche, che possono avere parassitemia persistente e di basso livello. La possibile ragione per la persistenza dell'antigene HRP-2 non è ben compresa; può riflettere la presenza di parassiti latenti e vitali (probabilmente il risultato di un fallimento del trattamento) o di complessi solubili di antigene-anticorpo.

La persistenza può anche dipendere dal tipo di terapia antimalarica istituita. Il segnale HRP-2 può persistere per 19 giorni dopo chinasi apparentemente efficace e terapia con doxiciclina. È stata osservata anche persistente antigenemia HRP-2 durante e dopo la terapia con artemetere.

Altre limitazioni sono specificamente correlate agli aspetti tecnici del sistema HRP-2. Ad esempio, le IgG monoclonali utilizzate nel sistema ParaSight F possono incrociarsi reagire con il fattore reumatoide e causare una falsa risposta positiva.

Il test Pf ICT utilizza un'IGM monoclonale, che non ha cross-reattività e non ci sono segnalazioni di reazioni falso-positive che si verificano con questo test a causa del fattore reumatoide. Tuttavia, il test ICT Pf richiede lo stoccaggio a 4 ° C, il che limita la sua utilità in situazioni di campo.

Saggi sierologici basati su pLDH:

I più recenti test sierologici rapidi per la diagnosi di malaria si basano sulla rilevazione di pLDH. Come i test basati su HRP-2, questi test sono sensibili, specifici e facili da eseguire, con risultati ottenibili in meno di 15 minuti.

I saggi basati su pLDH sono anche in grado di differenziare tra P. falciparum e altre specie di Plasmodium e, poiché la pLDH è prodotta solo da parassiti vitali, sono anche utili nel monitoraggio della terapia antimalarica. il pLDH da P. falciparum è differenziato dall'ospite LDH (h-LDH) con 3-acetilpiridina adenina dinucleotide (APAD), un analogo del Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD).

I test basati su pLDH sono disponibili in due forme, un semi-quantitativo, dry, dipstick (OptiMAL); e un saggio quantitativo di cattura immunoenzimatica. Il saggio OptiMAL utilizza due anticorpi monoclonali, uno specifico per P. falciparum e l'altro che riconosce tutti e 4 i Plasmodi.

Il campione di sangue esaminato (10 μl di puntura di dito, sangue intero o emolisato congelato) viene miscelato con 3oμL, tampone di lisi contenente anticorpi monoclonali coniugati. Questa miscela può essere immersa nell'OptiMAL, astina di livello.

Dopo 3 minuti, viene aggiunto il tampone di eliminazione da 100 μL. Se P. falciparum è presente nel campione di sangue, tre linee (inclusa una, nella parte superiore di ciascun bastone, che rappresenta il controllo positivo) si sviluppano su strisce reattive.

Due linee indicano P. vivax, P. malariae o occasionalmente, P. ovale. Una striscia OptiMAL-2 di nuova formattazione ha tre linee di test e una linea di controllo positiva, che consente di identificare tutte e quattro le specie di Plasmodium.

Ogni test viene considerato ualid solo se si sviluppa una linea di controllo. Gli anticorpi monoclonali utilizzati nel test OptiMAL sono stati testati in modo esaustivo per la cross-reattività con LDH da leishmania, babesia e batteri patogeni o funghi e non è stata trovata evidenza di tale cross-reattività.

HRP-2 è stato trovato a persistere bene dopo che la parassitemia periferica si era risolta. Sebbene i livelli di pLDH seguano da vicino la parassitemia periferica e siano scesi a valori non rilevabili 3-5 giorni dopo la chinasi e la doxiciclina, i livelli dell'antigene HRP-2 sono diminuiti dopo 19 giorni, ben dopo che il paziente è sintomo e apparentemente libero da parassiti.

Il saggio OptiMAL dovrebbe pertanto essere uno strumento prezioso nel monitoraggio della terapia antimalarica. La clearance della parassitemia e la clearance della pLDH sembrano parallele l'una all'altra.

I test OptiMAL sono molto versatili. Il test OptiMAL ha una sensibilità rispettivamente del 94 - 88% e una specificità del 100 e del 99% per P. vivax e P. falciparum, rispettivamente, rispetto agli strisci di sangue.

Questo test può essere utilizzato come strumento epidemiologico poiché, nelle aree in cui circolano più di una specie di Plasmodium, può essere utilizzato per identificare rapidamente le specie di Plasmodium che infettano i pazienti in ciascun villaggio e consentire agli operatori sanitari di fornire la chemioterapia più appropriata .

conclusioni:

Negli ultimi anni, gli sforzi per sostituire la lettura tradizionale e noiosa degli strisci di sangue (un metodo sviluppato quasi 100 anni fa) hanno portato a tecniche per l'individuazione di parassiti della malaria che producono sensibilità equivalenti o migliori della microscopia.

Sebbene i metodi basati sulla PCR siano probabilmente i più sensibili, sono così costosi e hanno bisogno di attrezzature e addestramento specialistici che è improbabile che vengano utilizzati per la diagnosi di routine nella maggior parte dei paesi in via di sviluppo.

Sono particolarmente utili per gli studi sulle differenze di ceppo, le mutazioni e i geni coinvolti nella resistenza ai farmaci nel parassita e per mostrare il livello di parentela tra i ceppi associati a diversi focolai di malaria. I test diagnostici della malaria più promettenti e nuovi sono i test sierologici delle aste di livello.

Questi test, tra cui ParaSight F, ICT Pf Test e OptiMAL, sono semplici da usare, facili da interpretare e producono risultati in 15 minuti o meno. Questi test sono sensibili quasi quanto l'esame al microscopio di strisci di sangue, ma non richiedono che il personale altamente qualificato esegua o interpreti i risultati.

Il test OptiMAL ha l'ulteriore vantaggio di essere in grado di rilevare tutte e quattro le specie di Plaspiodium e di seguire l'efficacia della terapia farmacologica, poiché misura un enzima prodotto solo da parassiti vivi.

Sebbene i test con l'asta di livello abbiano due ovvie limitazioni, nessuno dei due dovrebbe impedire a questi test di ricevere un'accettazione generalizzata. La prima limitazione è quella della sensibilità. I tre saggi attualmente in commercio hanno soglie di sensibilità di 50-100 parassiti / μ1. La sensibilità per i campioni con <50 parassiti / μL è costantemente del 50% -70%.

Questo livello di sensibilità potrebbe non essere un grosso problema per coloro che vivono stabilmente in aree endemiche, a cui spesso non viene somministrato alcun trattamento se non hanno più di 500 parassiti / ml di sangue, ma possono rappresentare un problema nella diagnosi di malaria in quegli individui che provengono da aree non endemiche ma vivono, lavorano o viaggiano in aree endemiche.

Tuttavia, poiché la stragrande maggioranza dei pazienti affetti da malaria presenta livelli di parassiti ben superiori a 50 parassiti / μL, pochi pazienti potrebbero essere diagnosticati erroneamente se i test con astina di livello venissero usati di routine. La seconda limitazione di tali test, almeno attualmente, è il loro costo.

L'Organizzazione Mondiale della Sanità ritiene che, per coloro che si trovano in aree endemiche a trarne vantaggio, i test diagnostici per la malaria dovrebbero costare meno di US $ 0, 40 / campione. A meno che i test con astina di livello non siano prodotti in grandi quantità, questo prezzo è irraggiungibile e non pratico per i produttori.

I costi attuali dei test sull'astina dipendono dalla posizione dell'acquirente e dal volume ordinato. Ad esempio, i costi dei test Pf della ICT vanno da 1, 30 USD / test nei paesi in via di sviluppo. I test Para 0Sight F vengono venduti per $ 1, 20 USD / test. La striscia optiMAL attualmente vende per $ 3, 00 / test.