Macchia di spore di batteri per differenziare le cellule di spora e vegetativa batterica

Scopo:

Tutti i batteri rimangono nelle loro "forme vegetative", se le condizioni ambientali sono favorevoli alle loro normali attività metaboliche.

In questa forma assumono nutrienti, crescono e si riproducono.

D'altra parte, la maggior parte di loro muore, quando le condizioni ambientali diventano avverse, come il freddo intenso, il caldo estremo, l'invecchiamento, la mancanza di sostanze nutritive, l'esposizione a radiazioni e sostanze chimiche tossiche.

Tuttavia, poche specie di batteri, possono sopravvivere in tali condizioni avverse cambiando se stessi in forme altamente resistenti e metabolicamente inattive chiamate "spore". In condizioni avverse, una spora viene prodotta all'interno di una cellula vegetativa per disidratazione e contrazione del suo contenuto cellulare.

Questa spora, formata all'interno della cellula batterica, è chiamata "endospora" (Figura 2.13). Se peggiorano le condizioni avverse, la cellula si rompe, rilasciando l'endospora, che ora diventa una cellula dormiente indipendente chiamata "spore".

Il processo di formazione delle spore è chiamato "sporogenesi". Le spore hanno strati spessi e relativamente impervi, come la corteccia spora e il rivestimento di spore, che proteggono la cellula da qualsiasi danno fisico. La spora guadagna la sua resistenza con diversi meccanismi, che non sono ancora stati chiaramente spiegati.

Quando le condizioni diventano favorevoli, gli strati che coprono la rottura delle spore e le spore danno luogo a una cellula vegetativa metabolicamente attiva. Questo processo è chiamato 'germinazione'.

Pertanto, in base alla capacità di formare spore, i batteri possono essere suddivisi in due gruppi come segue:

(1) Batteri sporigeni (Spore-formatori):

Un batterio, che può produrre una spora per sopravvivere in condizioni ambientali avverse, è un batterio che forma spore (spore-ex). Principalmente, i seguenti tre generi di batteri a forma di bastoncello possono produrre spore in condizioni ambientali avverse.

A. Batteri a forma di bastoncino aerobi

1. Bacillus spp.

B. Batteri anaerobici a forma di bastoncello

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Batteri non sporigeni (non spore-formatori):

Un batterio, che non può produrre una spora e, pertanto, muore nella sua forma vegetativa in condizioni ambientali avverse, è un batterio non spore-formante (non-spore-ex).

Lo scopo della colorazione delle spore è di differenziare le spore e le cellule vegetative di una spora e di differenziare i formatori di spore dai non-spore-formatori. La colorazione delle spore è utile anche per identificare i batteri appartenenti ai generi Bacillus, Clostridium e Desulfotomaculum.

Principio:

Le spore sono diverse dalle cellule vegetative in quanto possiedono strati spessi relativamente impermeabili attorno a loro (Figura 2.14). La macchia primaria, verde malachite, non può penetrare nelle spore attraverso questi strati.

Pertanto, la penetrazione della macchia primaria è aumentata dall'applicazione del calore, che lo guida attraverso gli strati di copertura nel protoplasto di spore. Ora, le spore appaiono verdi. Quando le spore vengono trattate con l'agente decolorante, l'acqua del rubinetto, non subiscono decolorazione, in quanto escludono l'acqua.

L'acqua del rubinetto rimuove solo la macchia primaria in eccesso presente nell'intorno delle spore. Pertanto, le spore mantengono il colore verde. Successivamente, quando sono contro-macchiate con safranina, le molecole di safranina non possono entrare nelle spore attraverso gli strati di copertura. Così, finalmente le spore mantengono il colore verde della macchia primaria e appaiono verdi.

D'altra parte, le cellule batteriche vegetative assorbono facilmente la macchia primaria, verde malachite, ma la macchia non ha una forte affinità per i componenti delle cellule vegetative, a causa della quale viene lavata via, quando decolorata sotto l'acqua del rubinetto.

Ora, le cellule vegetative appaiono incolori. Quando sono contro-macchiate con safranina, le cellule vegetative incolori prendono la macchia e appaiono rosse a differenza delle spore, che appaiono verdi.

Materiali richiesti:

Diapositiva, cappio, verde malachite, safranina, batteri sporigeni, piastra riscaldante, microscopio, olio per immersione.

Procedura:

1. Un vetrino viene pulito correttamente sotto l'acqua del rubinetto, in modo che l'acqua non rimanga come gocce sulla sua superficie.

2. L'acqua aderente viene eliminata con carta bibula e il vetrino viene asciugato all'aria.

3. Una macchia di batteri sporigeni viene prodotta al centro di una diapositiva in due modi, come indicato di seguito.

(un) Se si osservano spore cresciute su piastra di agar o inclinazione di agar, una goccia d'acqua viene posta al centro del vetrino. Un ciclo viene sterilizzato su fiamma e un ciclo di batteri di Clostridium da una piastra invecchiata o coltura inclinata (48-72 ore) di spore, come i supergrini di Clostridium o il Bacillus subtilis, viene trasferito alla goccia d'acqua.

Quindi, mediante una delicata rotazione del cappio nella goccia d'acqua, viene creata una sospensione di batteri e la goccia viene distribuita fino a ottenere uno striscio. All'aumentare dell'età dei batteri sporigeni sulle colture in piastre o in pendenza, essi formano spore.

(B) Se si osservano spore cresciute in brodo liquido, la coltura di brodo, contenente solo cellule vegetative, viene sottoposta a stress da calore, scaldando a bagnomaria per 15 minuti, in modo che alcune cellule vegetali formino spore per superare il stress termico. Una goccia della sospensione cellulare spore-vegetativa mista proveniente dalla coltura di brodo viene posizionata direttamente al centro della diapositiva mediante un'ansa sterile e viene effettuata una diffusione mediante diffusione.

4. La macchia è asciugata all'aria.

5. Lo striscio è fissato dal riscaldamento. Il riscaldamento si traduce in coagulazione delle proteine ​​cellulari, a causa delle quali le cellule si attaccano alla superficie del vetrino e non vengono lavate via durante la colorazione, la fissazione del calore avviene facendo passare rapidamente il vetrino sopra una fiamma 2-3 volte, con lo striscio superficie rivolta verso l'alto, in modo che lo striscio non si riscaldi.

6. La macchia è inondata dalla macchia primaria, verde malachite.

7. Il vetrino viene tenuto su una piastra calda e la preparazione viene lasciata a vapore per 2-3 minuti. La temperatura della piastra riscaldante è regolata in modo tale che la preparazione non bolle e si evapori rapidamente. La perdita di evaporazione viene ripristinata, in modo che lo striscio non si asciughi.

8. Il vetrino viene rimosso dalla piastra riscaldante e raffreddato.

9. Lo striscio viene decolorato lavando sotto l'acqua del rubinetto che scorre gentilmente, in modo che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

10. Lo striscio è inondato con la contro-macchia, safranina, per 30 secondi.

11. La contro-macchia in eccesso viene completamente lavata via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo tale che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

12. Il vetrino viene asciugato con carta bibula.

13. La diapositiva viene agganciata allo stadio del microscopio e lo striscio osservato sotto obiettivi a bassa potenza e ad alto secco.

14. Una goccia di olio per immersione viene applicata allo striscio.

15. Lo striscio è osservato sotto l'obiettivo di immersione dell'olio.

Osservazioni (sotto l'obiettivo di immersione in olio):

1. Colore delle celle:

Verde: Spore (notare la posizione della spora)

Rosso: cellula vegetativa

2. Forma dei batteri:

Sferico (coccus)

A forma di bastoncello (bacilli)

Simile a virgola (vibrione)

Spirale (spirochete)

3. Disposizione dei batteri:

Coppie (diplobacillus / diplococcus)

A quattro (tetradi)

In catene (streptococco / streptococco)

Grappoli d'uva (staphylococcus)

Cuboidal (sarcinae o ottetto)

4. Dimensione dei batteri:

Con la stima dell'occhio, fai il disegno del campo sotto l'obiettivo di immersione in olio.