Primi 3 passaggi sequenziali di Polymerase Chain Reaction (PCR)

I seguenti punti evidenziano i primi tre passaggi sequenziali della reazione a catena della polimerasi (PCR). I passaggi sequenziali sono: Denaturazione 2. Ricottura 3. Estensione del DNA.

Passaggio sequenziale # 1. Denaturazione:

Il primo passo è quello di denaturare il DNA (sia il Primer DNA che il Native DNA). La separazione di due filamenti di DNA è nota come denaturazione mentre l'unione di due supporti viene chiamata ricottura o ibridazione (Fig. 48.1). La scoperta di denaturazione e ricottura del DNA è stata fatta artificialmente da Marmor e Lane (1960).

Secondo loro, il DNA a doppio filamento potrebbe essere separato in due singoli filamenti separati (denaturazione) mediante riscaldamento ad alta temperatura (90-95 ° C) e ibridazione o unione di due filamenti di DNA (DNA a doppio filamento) che è possibile mediante diminuzione della temperatura (50-56 ° C).

Questo è il principio principale su cui funziona la PCR. Il secondo principio è l'estensione del primer con l'aiuto dell'enzima DNA polimerasi.

Il DNA nativo, il primer e l'enzima DNA polimerasi (Tag polimerasi) vengono aggiunti in una provetta PCR e la temperatura viene aumentata e abbassata nella macchina PCR per denaturare e ibridare.

Sequential Step # 2. Ricottura:

Dopo aver denaturato il DNA, il passo successivo è quello di consentire al primer sintetizzato di ricoprire i filamenti di DNA opposti della sequenza bersaglio desiderata. La ricottura (ibridazione) può verificarsi se la temperatura da 95 ° C viene abbassata a 50/56 ° C. La temperatura viene quindi abbassata nella macchina.

Non appena la temperatura si abbassa, i filamenti di DNA nativo si legheranno non solo l'un l'altro, ma legheranno anche i primer. Questa specifica ibridazione, o "ricombinazione" di nucleotidi complementari, fornisce sia la base logica che la base pratica per gran parte del DNA ricombinante (Figura 48.2).

Passaggio sequenziale n. 3. Estensione del DNA (è necessario l'enzima Taq Polymerase):

Dopo che i primer sono stati ricotti, dovrebbero essere estesi usando il primer oligonucleotidico come punto di inizio. ha descritto che l'enzima DNA polimerasi è necessario per la sintesi del DNA. Pertanto, per l'estensione del primer abbiamo bisogno di una DNA polimerasi termostabile in modo che l'enzima non venga distrutto ad alta temperatura.

La polimerasi termostabile (Taq polimerasi) è isolata da Thermus aquaticus. La Taq polimerasi ha un enorme vantaggio nell'esecuzione della reazione PCR. Ha una temperatura di attività ottimale di circa 70 ° C e l'enzima fresco non deve essere aggiunto a ciascuna provetta dopo il processo di riscaldamento e raffreddamento.

La DNA polimerasi termostabile viene ora prodotta da diverse società con diverse fonti (diverse da Thermus aquaticus) con diversi nomi commerciali (TM). Per l'estensione del primer, la DNA polimerasi termostabile viene aggiunta nel tubo e la temperatura viene quindi portata a 65-70 ° C.

Cicli successivi di separazione dei filamenti (denaturazione), ibridizzazione dei primer (ricottura) e sintesi dei filamenti (estensione) assicurano l'amplificazione esponenziale delle sequenze target utilizzando la sequenza amplificata se il ciclo precedente come un nuovo modello, ci sono tre cicli (Fig. 48.2 ).

Primer Making:

I primer sono brevi sequenze (spesso RNA) per formare due nucleotidi, riferiti al primer, con uno per ciascuna estremità del frammento di DNA e forniscono una terminazione 3-OH libera a cui una DNA polimerasi avvia la sintesi di una catena di desossiribonucleotidi.

Una sequenza è fatta nella direzione senso, mentre l'altra è fatta nella direzione anti-senso. (Fig. 48.2). Il primer è utilizzato per innescare la sintesi di filamenti di DNA complementari e progettato in modo tale che il DNA tra i primer sia il frammento di interesse da amplificare.

Se l'RNA messaggero (mRNA) è amplificato, deve essere convertito in DNA complementare (cDNA) da una DNA polimerasi RNA-dipendente, trascrittasi inversa. Il complesso cDNA viene quindi modificato in DNA a doppio filamento, diventando un modello per una successiva reazione PCR.

Questo è spesso noto come reazione a catena della polimerasi transcriptasi inversa (RT PCR). I primer possono essere generati artificialmente o possono essere acquistati dalle aziende.

Una volta completata la reazione, i prodotti amplificati (DNA) possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel. L'importante proprietà fisica della molecola di DNA è che ogni singolo nucleotide possiede una carica negativa netta risultante dal gruppo fosfato.

Così frammenti di dimensioni diverse esposti a un campo elettrico tendono a migrare verso l'elettrodo positivo a velocità diversa a seconda della dimensione, con piccoli frammenti che migrano più velocemente di quello più grande. Questo processo di separazione basato sulla carica elettrica è chiamato elettroforesi.

I campioni di DNA, dopo essere stati digeriti in frammenti di dimensioni diverse da un enzima di restrizione (endonucleasi), vengono aggiunti per supportare terreno come gel di agrose o acrilammide. I pori del gel dipendono dalla sua percentuale e possono essere paragonati a un setaccio (molecolare). Pertanto, la velocità di migrazione dei frammenti di DNA attraverso il gel dipende dalla dimensione del frammento di DNA e dalla tensione applicata.

La procedura per separare e dedurre il frammento specifico del DNA è il Southern blotting. L'importanza di questa tecnica è che il frammento a singolo filamento può essere trasferito per azione capillare a un mezzo di supporto solido (membrana in nylon o cellulosa) e fissato permanentemente per riscaldamento (Fig. 48.3).

Dopo l'elettroforesi, il pattern del DNA può essere visualizzato sotto lampada UV dopo il trattamento con colorante di bromuro di etidio; il bromuro di etidio è una tintura fluorescente. L'elettroforesi su gel agroso distingue i frammenti da 100 paia di basi a 60000 paia di basi (60 kb) mentre i gel di poliacrilammide separano efficacemente i frammenti di 1000 coppie di basi (1 kb).

L'elettroforesi su gel a impulsi (PFGE) ha reso possibile la separazione di frammenti di DNA anche fino a 2kb. In questa procedura il campo elettrico viene alterato in diverse direzioni costringendo le molecole del DNA a riorientare tra ogni impulso o corrente elettrica. Questa è la tecnica migliore per identificare un gene conosciuto.

Le endonucleasi possono riconoscere 3, 4, 5, 6 o 8 coppie di basi e sono disponibili sul mercato.

Tamponi / sali PCR.

Per la Taq DNA polimerasi, il buffer viene prodotto come di seguito:

50 mM KCI

Tris-HCI 10 mM a temperatura ambiente

Il dimetilsolfossido (DMSO) e il glicole sono usati come co-solvente nei tamponi PCR quando il bersaglio ha una temperatura di denaturazione molto alta.

Il deossinucleotide trifosfato (dNTPs) è un cofattore di ioni.

Ora le aziende biotecnologiche stanno fornendo soluzioni preparate.

Il principio di base è descritto come segue:

Esistono quattro dNTP, ovvero dATP (adenina trifosfato), dCTP (citosina), dGTP (gunina), dUTP (uracile), che vengono utilizzati secondo le regole della coppia di basi per estendere il primer e infine per copiare la sequenza bersaglio.

Il dNTP si lega con Mg ²⁺ . La quantità di dNTP presenti in una reazione determinerà la quantità di Mg ²⁺ libera disponibile per l'attività enzimatica ottimale. Le soluzioni dNTP in stock devono essere neutralizzate con Tris base a pH 7.0 e la loro concentrazione deve essere determinata spettrofotometricamente.

Analoghi substrato e substrato:

La Taq polimerasi funziona (dNTP) in modo molto efficace. Tuttavia, sono disponibili alcuni substrati modificati al posto del substrato Tag DNA polimerasi. Sono dogoxigenin-dNTP, biotina-11-dUTP, C7deaza-dGTP e dNTPS marcato con fluorescenza.

I seguenti tipi di PCR sono generalmente in uso:

(1) PCR nidificata;

(2) RT-PCR;

(3) Ancoraggio PCR;

(4) PCR asimmetrica;

(5) PCR inversa;

(6) DOP-PCR.