Esperimento sull'esecuzione di colorazione acido-rapida di un batterio

Sperimenta l'esecuzione di colorazione acido-rapida di un batterio per scoprire se è acido-veloce o non acido-veloce!

Scopo:

La maggior parte dei batteri può essere macchiata, sia per semplice colorazione di base o per colorazione di grammi, poiché le loro cellule assorbono facilmente le macchie.

Tuttavia, alcuni batteri possiedono una spessa parete cellulare cerosa fatta di materiali lipidici.

Tali batteri sono estremamente difficili da colorare, poiché le normali macchie acquose non possono entrare facilmente nelle loro cellule, ma una volta colorate; è altrettanto difficile rimuovere la macchia dalle loro cellule, anche con l'uso vigoroso di alcol acido come agente decolorante. Questi batteri sono macchiati da una colorazione acido-rapida.

Pertanto, la colorazione acido-rapida, simile alla colorazione del grammo, è un metodo di colorazione differenziale, che differenzia i batteri, in base alla natura della loro parete cellulare, in due gruppi come segue:

(1) Batteri acido-veloci:

Un batterio, che è estremamente difficile da colorare, ma una volta macchiato, è altrettanto difficile rimuovere la macchia dalle sue cellule, anche con l'uso vigoroso di alcol acido come agente decolorante, è un batterio acido-veloce (acido-amare batteri).

Esempi: Mycobacterium spp. [M. tubercolosi (batteri TB), M. leprae (batteri lebbra), M. smegmatis (batteri naturali di smegma) e M. marinum (batteri TB di pesci marini). Possiedono una spessa parete cellulare cerosa fatta di materiali lipidici.

(2) Batteri non acidi-veloci:

Un batterio, facile da colorare e facile da decolorare con l'alcol acido come agente decolorante, è un batterio non acido-veloce (batteri che non amano l'acido). Esempi: tutti i batteri tranne Mycobacterium spp. In questi batteri, la parete cellulare non è densa e cereo.

La colorazione acido-rapida è utile nel differenziare i batteri acido-veloci e non-acidi-veloci e anche nell'identificazione di batteri appartenenti al genere Mycobacterium.

Principio:

I batteri acido-veloci sono diversi dai batteri non acidi-veloci in quanto, possiedono una spessa parete cellulare cerosa fatta di materiali lipidici. Macchie acquose ordinarie, come blu di metilene o viola di cristallo, non possono entrare nelle loro cellule attraverso questa parete cellulare cerosa.

Tuttavia, il color rosso fenolico primario carbol fuchsin (acido fenico o fenolo + fucsina basica); che è solubile nei materiali lipidici della parete cellulare, può entrare nelle loro cellule attraverso la parete cellulare e può essere trattenuto all'interno delle cellule impartendo loro un colore rosso.

La penetrazione è ulteriormente aumentata dall'applicazione del calore, che spinge carbol fuchsine attraverso il muro lipoidale nel citoplasma. (Una leggera modifica di questo metodo Ziel-Neelsen descrive l'aggiunta di un agente umidificante, Turgitol, alla colorazione, che riduce la tensione superficiale tra la parete cellulare e la macchia, senza richiedere quindi alcun riscaldamento). Le cellule sono lasciate raffreddare, in modo da indurire la parete cellulare cerosa.

Quando le cellule sono esposte all'agente decolorante, acido-alcolico, resistono alla decolorazione, poiché la macchia primaria è più solubile nelle cere cellulari che nell'agente decolorante. Successivamente, quando è contro-macchiato con blu di metilene, non può entrare nelle cellule attraverso la parete cellulare cerosa.

Così, finalmente i batteri acido-resistenti mantengono il colore rosso della macchia primaria e appaiono rossi. D'altra parte, i batteri non acidi resistono facilmente alla macchia primaria e subiscono facilmente la decolorazione. Contaminate con il blu di metilene, queste cellule incolori assorbono facilmente la contro-macchia e appaiono blu, a differenza dei batteri acido-resistenti, che appaiono rossi.

Materiali richiesti:

Diapositiva, cappio, macchia primaria (carbol fuchsine), agente decolorante (acido-alcol), contro-macchia (blu di metilene), piastra riscaldante, brodo / inclinazione / piastra coltura di batteri, microscopio, olio per immersione.

Procedura:

1. Un vetrino viene pulito correttamente sotto l'acqua del rubinetto, in modo che l'acqua non rimanga come gocce sulla sua superficie (Figura 5.12).

2. L'acqua aderente viene eliminata con carta bibula e il vetrino viene asciugato all'aria.

3. Uno striscio di batteri viene preparato al centro della diapositiva in due modi come segue.

(a) Se si osservano i batteri cresciuti su piastra di agar o inclinazione dell'agar, una goccia d'acqua viene posta al centro del vetrino e un anello di batteri dalla piastra o inclinazione viene trasferito ad esso da un ciclo sterilizzato su fiamma . Quindi, mediante una lenta rotazione del cappio nella goccia, viene fatta una sospensione batterica che viene dispersa fino a ottenere uno striscio.

(b) Se si osservano batteri cresciuti in un brodo liquido, una goccia della sospensione di batteri viene posizionata direttamente al centro del vetrino da un'ansa sterilizzata dalla fiamma e si fa uno striscio diffondendosi.

4. La macchia è asciugata all'aria.

5. Lo striscio è fissato dal riscaldamento. Il riscaldamento si traduce nella coagulazione delle proteine cellulari, grazie alle quali le cellule si attaccano alla superficie del vetrino e non vengono lavate via durante la colorazione. La fissazione del calore avviene facendo passare rapidamente il vetrino sopra una fiamma 2-3 volte, con la superficie smear rivolta verso l'alto, in modo che lo striscio non si riscaldi.

6. La macchia è inondata di carbol fuchsin

7. Il vetrino viene posizionato su una piastra calda calda, consentendo alla preparazione di vapore per 5 minuti. La temperatura della piastra riscaldante è regolata in modo tale che la preparazione non bolle e si evapori rapidamente. La perdita di evaporazione viene ripristinata, in modo che lo striscio non si asciughi. (Per il metodo senza calore, lo striscio viene inondato per 3-5 minuti con carbol fuchsin contenente Turgitol).

8. Il vetrino viene rimosso dalla piastra riscaldante e raffreddato.

9. L'eccesso di macchie viene lavato via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo tale che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

10. L'agente decolorante, acido-alcol, viene aggiunto sullo striscio goccia a goccia, fino a quando carbol fuchsin non riesce a lavare dallo striscio.

11. L'alcool acido viene lavato via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo tale che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

12. Lo striscio viene inondato con la contro-macchia, blu di metilene, per 2 minuti.

13. La contro-macchia in eccesso viene lavata via dallo striscio sotto l'acqua del rubinetto che scorre dolcemente, in modo tale che l'acqua non cada direttamente sullo striscio.

14. Il vetrino viene asciugato con carta bibula.

15. La diapositiva viene agganciata allo stadio del microscopio e lo striscio viene osservato in caso di obiettivi a bassa potenza e alto secco.

16. Una goccia di olio per immersione viene applicata allo striscio.

17. Lo striscio è osservato sotto l'obiettivo di immersione dell'olio.