Passaggi coinvolti nella reazione a catena della polimerasi nella sequenza del DNA
Alcune delle fasi principali coinvolte nella reazione a catena della polimerasi nella sequenza del DNA sono: 1. Fase 1: denaturazione per calore 2. Fase 2: ricottura del primer alla sequenza target 3. Fase 3: estensione 4. Fase 4: fine del primo ciclo PGR .
La reazione a catena della polimerasi (PGR) amplifica un singolo pezzo di DNA su diversi ordini di grandezza, vedi figura 6.2. È la creazione di migliaia o milioni di copie di una particolare sequenza di DNA.
1. Fase 1: denaturazione per calore:
Il calore è normalmente più di 90 gradi Celsius a separare il DNA a doppio filamento in due singoli filamenti. Questo processo è noto come "denaturazione". I legami a idrogeno che collegano le basi l'uno con l'altro sono deboli, quindi la denaturazione è possibile. I legami idrogeno si rompono a temperature elevate, mentre i legami tra desossiribosio e fosfati, rimangono intatti in quanto questi sono più forti rimangono intatti.
2. Fase 2: ricottura del primer alla sequenza target:
L'obiettivo finale di PGR è replicare una sequenza bersaglio di circa 100-600 coppie di basi uniche per l'organismo studiato. Il targeting della sequenza viene ottenuto utilizzando i primer. I primer segnano le estremità della sequenza bersaglio.
I primer per test AMPLICOR® sono sequenze corte e sintetiche di DNA a filamento singolo, tipicamente costituite da 20-30 basi, con un'estremità 5 'marcata con biotina per facilitare il rilevamento. Per la regione target dell'organismo, sono specifici. PGR ha due primer, uno per ciascuno dei filamenti di DNA singolo complementari che è stato prodotto durante la denaturazione dei singoli filamenti di DNA che è stato prodotto durante la denaturazione.
L'inizio della sequenza di destinazione del DNA di interesse è contrassegnato dai primer che annealing (binding) alla sequenza complementare. La ricottura avviene di solito tra 40 gradi Celsius e 65 gradi Celsius, a seconda della lunghezza e della sequenza base dei primer.
3. Fase 3: Estensione:
La temperatura viene innalzata a circa 72 gradi Celsius dopo che i primer si sono ricondotti alle sequenze complementari di DNA. Inoltre, l'enzima Taq DNA polimerasi viene utilizzato per replicare i filamenti di DNA. La DNA polimerasi Taq è una DNA polimerasi termoconduttiva ricombinante proveniente dall'organismo che Thermus aquatics us e a differenza dei normali enzimi della polimerasi è attiva a temperature elevate.
Il processo di sintesi sintetizza nuove molecole di DNA a doppio filamento, entrambe identiche alla regione del DNA bersaglio a doppio filamento originale, facilitando il legame e l'unione dei nucleotidi complementari che sono liberi in soluzione (dNTP). L'estensione inizia sempre all'estremità 3 'del primer facendo un doppio filamento da ciascuno dei due singoli fili. La DNA polimerasi Taq sintetizza esclusivamente nella direzione da 5 'a 3'.
4. Fase 4: fine del primo ciclo PGR:
Ora ci sono due nuovi filamenti di DNA identici all'obiettivo originale alla fine del primo ciclo PGR. I trefoli appena formati hanno un inizio, che è definito con precisione dall'estremità 5 'del primer, ma l'estremità 3' non è definita con precisione.
Il filamento di DNA sintetizzato da un tale modello ha quindi una lunghezza definita con precisione che è limitata alle due estremità dall'estremità 5 'di ciascuno dei due primer. Questi filamenti di DNA sono conosciuti come AMPLIGON. Filamenti di DNA che corrispondono alla sequenza bersaglio. Dopo solo pochi cicli, sono presenti in numeri molto più grandi delle sequenze di lunghezza variabile. La sequenza affiancata o definita dai due primer è la sezione che viene amplificata.
