Ibridazione fluorescente in situ (FISH)

In questo articolo parleremo dell'ibridazione in situ fluorescente (FISH).

È una tecnica di laboratorio utilizzata per determinare quante copie dello specifico segmento di DNA sono presenti in una cellula. Identifica la regione cromosomica specifica nei preparati citologici. In laboratorio, un segmento di DNA è chimicamente modificato o colorato da una tintura fluorescente e quando esaminato al microscopio a fluorescenza sembra fluorescente colorata molto brillante.

L'ibridazione in situ fluorescente ha notevolmente aumentato la sensibilità, la specificità e la risoluzione dell'analisi cromosomica.

I vantaggi di questa tecnica sono numerosi ma alcuni sono citati come segue:

(1) La risoluzione di questo metodo è molto migliore di quella delle bande cromosomiche tradizionali e di circa 2 mega-basi (Mb) in lunghezza.

(2) Il protocollo di questa tecnica è semplice ed è applicabile sia per le cellule in divisione che per quelle non in divisione. Questa tecnica può identificare una serie di mutazioni tra cui eliminazione, duplicazione, aneuploidia e presenza di cromosomi derivati. Questa tecnica è anche comunemente usata per monitorare la malattia ricorrente o residua nei pazienti sottoposti a trapianto di midollo osseo.

FISH (Ibridazione fluorescente in situ) viene generalmente eseguita su sangue periferico stimolato sia per l'analisi cromosomica che per l'identificazione di traslocazioni e delezioni specifiche. Ad esempio, è usato per dimostrare il cromosoma Philadelphia (Ph ¹ ) formato dalla traslocazione tra il cromosoma 9 e 22 e causa una leucemia mieloide cronica (LMC).

Viene anche utilizzato nell'identificazione della traslocazione tra il cromosoma 8 e 14 che causa il linfoma di Burkitt e tra il cromosoma 18 e 14 che provoca la leucemia a cellule B. Viene anche usato per la diagnosi della sindrome di Down.

Nella procedura FISH, è possibile preparare colture cellulari. I cromosomi metafase / prometaphase sono fissati su un vetrino. Inoltre, FISH può essere modificato per l'analisi dei nuclei interfase. Quindi, i cromosomi sono denaturati; una sonda di DNA marcata viene quindi introdotta e quindi sonda ibridata sul cromosoma sulla diapositiva. Pertanto, viene data l'ibridazione "in situ".

Le sonde del DNA sono marcate con fluorocromo, tale sonda fornisce un segnale fluorescente e potrebbe essere vista con la microscopia a fluorescenza. La fluorescenza può essere dedotta con l'aiuto di filtri applicati nel microscopio a fluorescenza.

Le sonde FISH hanno una lunghezza di circa 40 chilogrammi (kb) e sono rilevate come un doppio segnale fluorescente su ciascun membro di una coppia cromosomica. Il doppio punto corrisponde ai segnali di ciascuno dei due cromatidi fratelli allineati.

Nella sua semplice applicazione, un normale pattern FISH per qualsiasi sonda di questo tipo sarebbe costituito da due serie di punti doppi, un set per ciascun membro dei cromosomi normalmente accoppiati. Questi doppi punti si fondono spesso per formare un segnale. Le cellule monosomiche per la regione cromosomica in questione mostrerebbero solo un singolo set di doppio punto per nucleo, mentre le cellule trisomiche mostrerebbero tre serie di punti doppie.