Saggi di funzione dei neutrofili
Saggi sulle funzioni dei neutrofili!
1. La chemiotassi dei neutrofili può essere valutata con i seguenti metodi:
un. Saggio della camera di Boyden modificato:
La camera di Boyden è composta da una camera superiore e una inferiore separate da un filtro con piccole dimensioni dei pori.
La sospensione di neutrofili viene posizionata nella camera superiore e una sostanza chemiotattica viene collocata nella camera inferiore. L'entità della migrazione dei neutrofili viene valutata contando il numero di neutrofili intrappolati nel filtro e il numero di neutrofili nella camera inferiore mediante citometria a flusso.
b. I pozzi sono punzonati in un agar semisolido:
Sospensione di neutrofili, sostanza chemiotattica e una sostanza non chemiotattica sono posti in pozzetti diversi. La migrazione delle cellule attraverso l'agar semi solido verso il pozzetto contenente la sostanza chemiotattica viene determinata al microscopio. La migrazione verso la sostanza non chemiotattica rappresenta bene il movimento casuale delle cellule (noto come chemio chinesis).
2. Fagocitosi dei neutrofili:
Una varietà di particelle può essere utilizzata per valutare la capacità fagocitica dei neutrofili. Le particelle sono incubate con neutrofili e successivamente osservate microscopicamente per la presenza delle particelle all'interno dei neutrofili. Le particelle legate alla superficie cellulare vengono rimosse con il trattamento acido, in modo che le particelle legate alla superficie cellulare non vengano contate come particelle intracellulari.
Sono ora disponibili anche particelle fluorescenti marcate o radioattive che consentono il conteggio diretto delle particelle da parte dei fagociti.
3. Determinazione del burst respiratorio e degranulazione:
La malattia granulomatosa cronica (CGD) è una malattia da immunodeficienza in cui l'uccisione intracellulare da parte dei fagociti è influenzata dall'incapacità delle cellule fagocitiche di produrre anione superossido (O 2 - ).
un. Test di diapositiva Nitroblue tetrazolium (NBT):
NBT è un colorante trasparente, giallo, solubile in acqua. NBT è ridotto a un blu profondo, formazon di O 2 - . I neutrofili vengono attivati mediante trattamento con PMA o esposizione a LPS. I neutrofili attivati vengono quindi incubati con NBT. Se i neutrofili producono O 2 -, l'NBT si riduce al blu profondo del formazon e viene visualizzato al microscopio. Un saggio quantitativo può essere fatto estraendo il formazon dai neutrofili e testando il formazon con uno spettrofotometro. I bambini con completa carenza di attività della NADPH ossidasi mostrano una deficienza grave nel test NBT. Ma i bambini con parziale perdita di attività della NADPH ossidasi sono meglio rilevati dal dosaggio quantitativo.
b. Dosaggio citometrico a flusso con 2'7'-dicloro-fluoresceina (DCF):
L'O 2 - formata durante l'attività della NADPH ossidasi viene convertita in H 2 O 2 dall'enzima superossido dismutasi. H 2 O 2 è un'altra sostanza chimica microbicida. H 2 O 2 ossida il composto non fluorescente DCF in un composto fluorescente, che viene rilevato dal citometro a flusso.
I fagociti sono incubati con DCF e DCF entra nelle cellule.
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Quindi i neutrofili vengono attivati da PMA o altri agenti.
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Quindi le cellule vengono analizzate nel citometro a flusso. Viene determinato un aumento della florescenza dei fagociti.
Il citometro a flusso consente inoltre la determinazione quantitativa di H 2 O 2 prodotta da singole cellule. Quindi l'analisi citometrica a flusso è utile nel rilevamento di difetti parziali nella funzione NADPH ossidasi o per lo screening per portatori eterozigoti della forma X-linked di CGD.
4. Degranulazione dei fagociti:
La degranulazione fagocitica è un processo di fusione dei lisosomi con i fagosomi, che porta alla scarica di contenuti lisosomiali nel fagolisosoma. La degranulazione è un processo attivo e richiede energia. La compromissione delle normali vie metaboliche dei neutrofili (in particolare, il consumo di ossigeno e il metabolismo del glucosio attraverso lo shunt monofosfato esoso) interferisce con la degranulazione; di conseguenza, è interessata l'uccisione intracellulare di microbi da parte dei fagociti.
La degranulazione dei fagociti in una sospensione può essere indotta da vari agenti attivanti e composti che influenzano il citoscheletro della cellula (come la citocalasina B). I fagociti rilasciano principalmente i granuli secondari e terziari e sono misurati con metodi ELISA.
io. La lattoferrina (un granulo neutrofilo secondario) è usata come marcatore di rilascio di granuli secondari.
ii. L'albumina viene dosata come misura del rilascio di granuli terziari.
Il test per il rilascio di granuli primari dai fagociti viene eseguito cercando il rilascio di granuli primari in spazi chiusi. "Fagocitosi frustrata" è un'analisi utilizzata per valutare il rilascio di granuli primari (Fig. 27.7).
I complessi di immunoglobuline o immunocomplessi aggregati al calore sono fissati a un petridish.
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I neutrofili vengono aggiunti al petridish e incubati. Attraverso i loro recettori Fc, i neutrofili si legano alle regioni Fc di immunoglobuline aggregate o complessi immunitari. Di conseguenza, i neutrofili cercano di fagocitare gli immunoglobuline o i complessi immunitari aggregati al calore. Ma i neutrofili non possono fagocitare loro (perché sono fissati alla capsula di Petri). Di conseguenza, i neutrofili rilasciano il loro contenuto granulare su di essi.
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La velocità di rilascio delle proteine primarie dei granuli, come la mieloperossidasi o la p-glucoronidasi, viene utilizzata per stimare la degranulazione. Le carenze nella sintesi di granuli primari / secondari possono anche essere rilevate colorando granuli intracellulari con mAbs marcati e citometria a flusso.
Uccisione batterica da parte di neutrofili:
Le analisi microbiche sono difficili da eseguire. Generalmente, i dosaggi microbicidi vengono eseguiti quando dosaggi più semplici non forniscono informazioni sufficienti.
Il ceppo di Staphylococcus aureus 502A è comunemente usato per valutare la capacità microbicida dei neutrofili.
Il ceppo Staphylococcus aureus 502A che cresce in fase logaria viene incubato con sieri umani (per fornire alle immunoglobuline e alle proteine del complemento la funzione di opsonina).
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I neutrofili appena isolati vengono aggiunti ad una concentrazione di 5-10 batteri / neutrofili.
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Dopo 30 minuti di incubazione, i batteri che non vengono inghiottiti dai neutrofili vengono uccisi con l'aggiunta della gentamicina. (Gentamidn non entra nei neutrofili e quindi i batteri fagocitati rimangono vivi).
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Aliquote di neutrofili vengono rimosse a intervalli di 30 minuti e mescolate con acqua distillata sterile per lisare i neutrofili e rilasciare i batteri. Il numero di batteri vitali in ciascuna aliquota viene misurato mediante diluizione seriale e placcatura su piastre di agar sangue.
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I risultati sono tracciati su un grafico.
io. I neutrofili normali mostrano una riduzione di due log in batteri intracellulari vitali dopo un'ora di incubazione.
ii. Virtualmente non vi è alcuna uccisione da parte dei neutrofili da pazienti CCD omozigoti.
iii. I neutrofili dai vettori eterozigoti di CGD mostrano l'uccisione parziale da parte dei neutrofili.
