7 Tecniche per l'osservazione di oggetti sotto microscopi elettronici
Alcune delle tecniche più importanti adottate per l'osservazione di oggetti al microscopio elettronico sono: (1) Shadow-casting (2) Negative Staining (3) Sezione ultrasottile (4) Freeze-etching (5) Localizzazione di costituenti di cellule (6) Localizzazione di Enzimi (7) Autoradiografia.
(1) Shadow-casting:
In fusione di ombre, l'oggetto microscopico viene essiccato in una griglia speciale posta all'interno di un barattolo sotto vuoto.
Uno strato estremamente sottile di metallo (ad es. Platino) viene depositato sull'oggetto da un filamento altamente riscaldato con un angolo obliquo, in modo che l'oggetto produca un'ombra sul lato non patinato.
L'esame dell'immagine ombreggiata fornisce informazioni sulla forma dell'oggetto (caratteristiche topografiche della superficie dell'oggetto), che possono essere osservate mediante microscopio elettronico a scansione.
(2) colorazione negativa:
Questa tecnica è seguita per osservare i minimi dettagli di oggetti molto piccoli, come i flagelli di virus e batteri. Un materiale elettrone-opaco come l'acido fosfotungstico o il suo sale possono formare uno strato di spesso deposito sulla superficie dell'oggetto, senza entrare in esso. Quando gli elettroni del cannone elettronico del microscopio elettronico non riescono a passare attraverso queste superfici rivestite, queste strutture diventano chiaramente visibili.
(3) Sezionamento ultrasottile:
Una cellula microbica intatta è troppo spessa per consentire la visualizzazione delle sue strutture fini interne al microscopio elettronico. Per l'osservazione delle strutture fini intracellulari, la cellula è inserita in un blocco di materiale plastico e tagliata in sezioni ultrasottili (sottili fino a 60 nm).
La struttura esatta viene interpretata osservando diverse sezioni ultrasottili sezionate a diversi livelli e ad angoli diversi. Il miglioramento del contrasto delle strutture è possibile attraverso l'uso di speciali macchie, come i sali di uranio e di lantanio.
(4) Liofilizzazione:
Per ottenere sezioni ultrasottili di un oggetto, esso deve essere riparato con trattamenti chimici. Tali trattamenti chimici provocano artefatti. Questi artefatti vengono risolti dal congelamento. Nell'incisione a freddo, il campione viene congelato all'interno di un blocco ed è sezionato, mentre è ancora contenuto al suo interno in condizioni di congelamento.
(5) Localizzazione di costituenti delle cellule:
È una tecnica speciale eseguita per localizzare i costituenti chimici delle cellule. Ad esempio, per localizzare un antigene in una cellula, una sezione ultrasottile della cellula viene trattata con un anticorpo marcato con ferritina, che si lega all'antigene per formare un complesso antigene anticorpo marcato con ferritina.
Poiché la ferritina è una sostanza contenente ferro ad alta densità, il complesso anticorpo-antigene influenza marcatamente il passaggio di un fascio di elettroni, producendo così un elevato contrasto per l'osservazione chiara al microscopio elettronico.
(6) Localizzazione di enzimi:
Questa tecnica viene utilizzata per localizzare la posizione degli enzimi all'interno delle cellule. Ad esempio, nel rilevamento dell'isocitrato deidrogenasi, vengono preparate sezioni ultrasottili di cellule di batteri. Quindi, l'oro colloidale viene apposto specificamente sull'enzima, seguendo una tecnica immunochimica. L'enzima colloidale fissato all'oro può essere osservato al microscopio elettronico.
(7) Autoradiografia:
È una tecnica citochimica, in cui la posizione di un particolare costituente chimico in un oggetto è determinata osservando il sito, in cui viene posizionato un materiale radioattivo. L'oggetto viene prima esposto alla sostanza radioattiva per consentirne l'assorbimento.
Quindi, è ricoperto da uno strato di emulsione fotografica e tenuto al buio per poche ore. Le radiazioni ionizzanti emesse durante il decadimento della sostanza producono immagini latenti nell'emulsione. Dopo l'elaborazione fotografica, le immagini sviluppate sono viste al microscopio elettronico come granelli di argento nella preparazione.
