Animali transgenici: obiettivi del trasferimento genico con diversi metodi di trasfezione

Animali transgenici: obiettivi del trasferimento genico con diversi metodi di trasfezione!

Un animale transgenico contiene nel suo genoma, un gene o geni introdotti dall'una o dall'altra tecnica di trasfezione.

Il gene introdotto dalla trasfezione è chiamato transgene. Nella trasfezione degli animali si specifica l'introduzione di un segmento di DNA, nudo o integrato in un vettore, in una cellula animale.

Obiettivi del trasferimento di geni:

1. La modifica genetica degli animali può essere finalizzata a migliorare la produzione di latte, carne, lana, ecc.

2. I geni sono stati trasferiti negli animali per ottenere una produzione su larga scala delle proteine ​​codificate da questi geni nel latte, nelle urine o nel sangue di tali animali.

3. Un caso particolare di trasferimento genico ha lo scopo di alleviare o addirittura eliminare i sintomi e le conseguenti sofferenze delle malattie genetiche. In questo approccio, le copie normali e funzionali del gene difettoso vengono introdotte nel paziente (terapia genica).

4. Specifici ceppi transgenici di origine animale o linee sono creati per soddisfare esigenze sperimentali e / o biomediche specializzate.

Metodi di trasfezione:

Sono stati usati diversi approcci per l'introduzione del DNA in cellule / embrioni animali che sono i seguenti:

(i) Precipitazione di calcio fosfato.

(ii) microiniezione diretta.

(iii) infezione da Retrovirus.

(iv) Lipofection.

(v) Consegna della pistola particellare e

(vi) elettropoiografia.

Precipitazione del fosfato di calcio:

In questo approccio, la preparazione del DNA da utilizzare per la trasfezione viene prima sciolta in un tampone fosfato. La soluzione di cloruro di calcio viene quindi aggiunta alla soluzione di DNA; questo porta alla formazione di fosfato di calcio insolubile che co-precipita con il DNA. Il precipitato di fosfato di calcio e DNA viene aggiunto alle cellule da trasfettare.

Le particelle precipitate vengono assorbite dalle cellule dalla fagocitosi. Inizialmente, l'1-2% delle cellule è stato trasfettato da questo approccio. Ma ora la procedura è stata modificata per ottenere la trasfezione fino al 20% delle cellule. In una piccola percentuale delle cellule trasfettate, il DNA viene integrato nel genoma cellulare producendo trasfusioni stabili o permanenti.

Questo approccio generale può essere applicato virtualmente a tutte le cellule di mammiferi e un numero molto elevato di cellule può essere trattato con poco sforzo. Ma a molte linee cellulari non piace il precipitato di fosfato di calcio che aderisce alle loro superfici o al loro substrato.

lipofezione:

La consegna del DNA nelle cellule usando liposomi si chiama lipofection. I liposomi sono piccole vescicole preparate da un lipide adatto. Inizialmente, i lipidi nonionici sono stati utilizzati per preparare i liposomi in modo che il DNA dovesse essere introdotto all'interno delle vescicole seguendo procedure di incapsidazione specifiche.

L'uso di lipidi cationici per la costruzione di liposomi è un netto vantaggio in quanto il DNA si complessa spontaneamente ed efficientemente con questi liposomi rendendo superflue le procedure di incapsidazione. I liposomi cationici hanno una singola membrana a doppio strato lipidico (unilamellare) e si legano efficacemente alle cellule. Probabilmente si fondono con la membrana plasmatica e quindi forniscono il DNA (complessato con loro) nelle cellule, il che determina la trasfezione.

La lipofection è il metodo di scelta per la trasfezione di cellule di mammifero in vitro. È stato anche utilizzato per somministrare il DNA in animali vivi mediante iniezione diretta o iniezione endovenosa. I liposomi cationici sono stati utilizzati per iniezione endovenosa o intratracheale nei topi per l'espressione dei geni marcatori nei polmoni. La consegna mirata è stata dimostrata anche incorporando specifiche proteine ​​del ligando nelle membrane liposomiali.

Infezione retrovirale:

I retrovirus ricombinanti producono virioni, che sono usati per infettare le cellule animali e gli embrioni di topi. Il genoma dell'RNA del retrovirus ricombinante viene copiato dalla trascrittasi inversa per ottenere una copia del DNA (trascrizione delle entrate), che viene integrata nel genoma della cellula. La trascrittasi inversa è codificata dal retrovirus e viene prodotta immediatamente dopo l'infezione.

Tuttavia, la trascrizione inversa può verificarsi solo in quelle cellule, che attraversano la fase S, cioè sono mitoticamente attive. La copia del DNA del retrovirus ricombinante si integra nel genoma cellulare in siti casuali e solitamente non è accompagnata da delezioni o riarrangiamenti.

microiniezione:

In questo metodo, la soluzione di DNA viene iniettata direttamente nel nucleo di una cellula o nel pronucleo maschile di un ovulo fecondato a due cellule. Tipicamente, un gruppo di microiniezione consiste in un microscopio a dissezione stereoscopica a bassa potenza (per visualizzare l'uovo e l'intero processo) e due micromanipolatori, uno per una micropipetta di vetro per trattenere l'ovum mediante aspirazione parziale e l'altro per un ago per l'iniezione di vetro per introdurre il DNA nel pronucleo maschile. Il pronucleo maschile è molto più grande del pronucleo femminile di ovuli di mammifero fecondato. Tuttavia negli ovuli di pesce, il DNA viene iniettato nel citoplasma dell'uovo.

La procedura generale per la microiniezione è la seguente: Le femmine donatrici sono indotte al superovulato con trattamenti ormonali appropriati. Le femmine superovulate vengono quindi accoppiate con maschi fertili e un gran numero di ovuli / embrioni fecondati a una o due cellule vengono raccolti chirurgicamente. In alternativa, gli ovuli non fecondati sono raccolti da femmine superovulate; le uova sono quindi fecondate in vitro. Il costrutto del transgene viene preparato in una soluzione tampone e viene iniettato nei pronomi dei maschi delle uova fecondate usando un microiniezione.