Crioconservazione dei gameti nei pesci
In questo articolo discuteremo della crioconservazione dei gameti nei pesci.
La crioconservazione è una tecnica di memorizzazione praticamente senza limiti di tempo. La conservazione dei gameti di pesce è stata provata con questa tecnica. La crioconservazione degli spermatozoi è una procedura consolidata in zootecnia.
Ora gli spermatozoi crioconservati vengono utilizzati con successo nell'inseminazione di bovini, cavalli, suini, ovini e allevamenti di pollame. È interessante notare che sono stati fatti grandi sforzi per trasferire questa tecnologia alla conservazione di spermatozoi, ovuli ed embrioni di pesci.
Questa tecnica aiuterà gli allevatori di pesci nei seguenti modi:
(1) Il problema della maturazione non-casuale del maschio e della femmina può essere superato, se gli spermatozoi o gli ovuli sono tenuti in deposito.
(2) Si può intraprendere il programma di allevamento selettivo che migliorerà la popolazione indigena e aiuterà il terzo mondo a allevare le loro specie autoctone ea produrre ceppi speciali di gambo superiore.
(3) La tecnica di crioconservazione dei gameti giocherà un ruolo importante nella conservazione del germoplasma indigeno poiché molti pesci indigeni indiani non possono competere con i pesci esotici. Con questa tecnica i gameti di specie minacciate vengono incassati come una barriera contro la variabilità genetica decrescente causata da disturbi ambientali.
(4) Può aiutare nella produzione della cultura mono-sesso.
(5) Se i gameti possono essere preservati con successo, possiamo sviluppare il pesce durante tutto l'anno secondo i nostri requisiti e aiutare a stabilire una banca genetica per preservare l'originalità genetica della popolazione e tenerli disponibili per la reintroduzione quando le condizioni generali di sopravvivenza sono migliorate.
Gli spermatozoi, le uova e gli embrioni possono essere crioconservati, ma la conservazione dell'uovo e degli embrioni è difficile a causa della non disponibilità del crioprotettore da assorbire sufficientemente in queste cellule a causa delle loro grandi dimensioni rispetto agli spermatozoi.
La crioconservazione degli spermatozoi nei pesci ha successo nell'uomo; specie Queste specie sono Oncorhynchus, Salmo, Salvilinus fontinalis, Hucho hucho, Thymallus thymallus, Esox lucius e Cyprinus carpio, Serothodon mossambicus; Labeo rohita, Catla catla e Cirrhinus mrigala.
I seguenti passi devono essere seguiti per preservare gli spermatozoi:
(1) Collezione di milt (sperma).
(2) Preparazione della soluzione di estensione.
(3) Selezione di crioprotettore.
(4) Congelamento.
(5) Successo alla fecondazione.
Collezione di Milt:
Il primo passo è raccogliere gli spermatozoi. Normalmente gli spermatozoi vengono raccolti da pesci sani mediante metodo di stripping. Il catetere può essere usato, che è un'alternativa migliore allo stripping. I riproduttori maschi con i migliori tratti caratteristici sono stati selezionati e lavati con la soluzione di Ringers e la regione delle papille genitali è stata essiccata.
La cova può essere anestetizzata o non anestetizzata. L'anestesia generalmente utilizzata è 0, 3 ml / l di fenossietanolo. Secondo Kumar (1989), un'iniezione di suston 250 (organon) prima dello stripping dà un risultato migliore nelle carpe indiane. La maggioranza dei lavoratori in questo campo raccomandava ai pesci non anestetizzati di spogliarsi per ottenere la milt.
Il milt viene raccolto in siringhe o tubi di emolisi e successivamente conservato in ampolle di vetro (sigillate o non sigillate), cannucce di plastica e spesso in sacchetti di plastica. Il colore, il volume, la densità, il pH e la motilità degli spermatozoi devono essere notati.
Il campione deve essere esente da materia urinaria e fecale. Uno striscio del campione deve essere esaminato al microscopio per rilevare anomalie negli spermatozoi. Se il campione è a posto, procedere all'ulteriore elaborazione, altrimenti si può prelevare un nuovo campione da nuovi allevamenti.
Durante il periodo di raccolta e conservazione degli spermatozoi, la siringa / ampolle / paglia può essere conservata nell'acqua dello stagno per mantenere la temperatura costante. Legendary e Billard (1980) hanno raccolto spermatozoi in provette per emolisi nel ghiaccio in fusione e quindi conservati su una superficie refrigerata a 4 ° C.
La preparazione e la selezione di extender, una soluzione in cui viene raccolta la milt, è la più critica per la crioconservazione. L'estensore impedisce l'esaurimento dell'energia spermatica e mantiene lo sperma in condizioni di quiscenza ma vivo.
Ci sono due estensori di base. Si chiamano Mounibs medium (M) e Menezo medium (Me). In questi due media si sono aggiunti albumina serun bovina (BSA) e tuorlo d'uovo tellurite. Per i pesci indiani, diversi estensori furono provati modificando i loro costituenti seguenti.
I costituenti comuni sono sodio cloruro, KCI, CaCl2, NaHCO 3, Na 2 HPO 4 e MgSO4. Oltre a questi, vengono aggiunti anche nutrienti e glicina per migliorare la crioconservazione. Gli antibiotici come la gentomicina o la streptomicina vengono anche aggiunti alla soluzione di estensione, se necessario.
cryoprotectant:
La funzione principale del crioprotettore è quella di penetrare nella cellula e può aiutare gli spermatozoi a tollerare la temperatura di congelamento. Il più importante e usato ampiamente è DSMO (dimetilsolfossido) e glicerolo. Harvey (1983) usò metanolo, DSMO e glicerolo in combinazione con latte in polvere o tuorlo d'uovo.
Soluzione di crioprotettore ed estensore in un rapporto fisso, generalmente una parte del crioprotettore e nove parti della soluzione di estensione è nota come diluente. In questo diluente gli spermatozoi vengono raccolti per ulteriori elaborazioni per il congelamento.
Il diluente (crioprotettore + estensore + spermatozoi) viene preso in cannucce di polivinile ed entrambe le estremità delle cannucce sono sigillate e ora sono pronte per il congelamento o il raffreddamento. La temperatura può essere refrigerata, la temperatura viene mantenuta tra 0-5 ° C. Durante il congelamento, vengono utilizzati CO 2 e azoto liquido. Lo stoccaggio refrigerato di teleost milt (0-50 o C) è stato studiato estesamente nei Salmonidi.
Nella procedura di congelamento dovrebbero essere controllati molti problemi come shock da freddo, formazione di ghiaccio intracellulare e shock osmotico. La crioconservazione generalmente significa deposito di cellule o tessuti a -196 o C, la temperatura dell'azoto liquido (Figura 22.1).
La lesione cellulare deve essere controllata. Generalmente si verificano tre tipi di lesioni cellulari. Il primo è lo shock da freddo, causato dal raffreddamento al di sopra delle temperature di congelamento. Questo è più importante per gli ovuli, non molto importante per gli spermatozoi.
Questo si verifica fino a 0 ° C. Quando la temperatura passa da 0 ° C a -80 ° C, si verifica lo shock osmotico e la formazione di ghiaccio intracellulare negli ovuli e negli spermatozoi. Per una crioconservazione di successo queste cose sono controllate.
In breve, le cannucce contenenti diluente vengono trasferite nei contenitori. I cannisters che trattengono cannucce dopo aver concesso un periodo di equilibrio variabile vengono immersi prima in vapori di azoto liquido e poi in azoto liquido alla temperatura di -196 ° C. Legendra e Billard (1980) hanno immagazzinato gli spermatozoi di trote arcobaleno in ghiaccio secco (CO 2 -79 ° C) o in azoto liquido fino a 6 mesi.
In un certo numero di specie di acqua dolce il congelamento è stato effettuato pellettando gli spermatozoi di sospensione in ghiaccio secco. Il passaggio da 0 ° C a -70 ° C dura circa 2 minuti, con una frequenza di 35 ° C / min. Poiché la velocità diminuisce sopra - 60 ° C. I migliori risultati si ottengono in azoto liquido.
scongelamento:
Lo scongelamento è un evento inverso di congelamento. Lo scongelamento avviene a bagnomaria a temperature comprese tra 10 ° C e 60 ° C. Il successo dell'intera procedura dipende dalla motilità degli spermatozoi e dalla capacità di fertilizzare gli ovuli.
Stoss e Holtz (1982) hanno aumentato la motilità degli spermatozoi di salmone rosa da 30 secondi a 10 minuti attivando con una soluzione di NaHCO 3 a 120 nm a cui era stato aggiunto 1 BMX (3-isobutil-1-metil xanthium). Kumar (1989) ha affermato che la durata del periodo di conservazione è di circa 20 giorni in L. rohita e H. molitrix in condizioni criogeniche.
Le uova di Salmo gairdeneri, Onchorhynchus kisutch e O.keta sono state fissate rimuovendo il processo di strippaggio e sigillate in sacchetti di plastica insieme al fluido celomelico e tenute sotto ossigeno a 1 ° C. Le uova vengono quindi lasciate spargere per formare uno strato di uno o due uova in profondità.
Le uova quindi miscelate con la soluzione di estensione e il crioprotettore quasi in modo simile a quello descritto in precedenza per gli spermatozoi. Secondo Harvey e Kelley (1984), la conservazione degli ovuli non congelata (refrigerata) ha avuto un discreto successo nei salmonidi, con tempi di conservazione dell'ordine di alcune settimane ottenuti attraverso la refrigerazione delle uova ossigenate nel fluido coelomico.
